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Titel: Entwicklung und statistische Validierung eines Biomarkers für Leberkrebs basierend auf den posttranslationalen Modifikationen von Fibrinogen und Entwicklung eines Bioinformatischen Tools zur Integration von LC-MS und NMR
Sonstige Titel: Development and statistical Validation of a Biomarker for Liver Cancer based on the posttranslational Modifications of Fibrinogen and Bioinformatic Tools for Integration of LC-MS and NMR
Sprache: Deutsch
Autor*in: Nagel,Tim
GND-Schlagwörter: Biomarker; Glykosylierung; Phosphorylierung; Krebs <Medizin>; Flüssigkeitschromatographie; Massenspektrometrie; Magnetische Kernresonanz; Krebs
Erscheinungsdatum: 2017
Tag der mündlichen Prüfung: 2018-03-09
Zusammenfassung: 
In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Erkennung von Leberkrebs entwickelt. Leberkrebs wird häufig spät entdeckt und hat daher eine der niedrigsten 5 Jahres Überlebensraten. Der Hauptrisikofaktor für Leberkrebs ist Leberzirrhose, welche meist durch Alkoholmissbrauch, NASH (non alcoholic steatohepatitis) oder Infektion mit Hepatitisviren ausgelöst wird. Aus diesem Grund sind einfache und schnelle Detektionsmethoden für Leberkrebs von größtem medizinischem Interesse.
Fibrinogen wird hauptsächlich in der Leber hergestellt und stellt daher ein optimales Ziel zur Erkennung von Leberkrankheiten dar. Bei der hier entwickelten Methode wird Fibrinogen aus humanem Blutplasma mittels Ethanolfällung isoliert. Die drei Untereinheiten (Aa, Bb und g) werden reduziert, flüssigkeitschromatographisch voneinander getrennt und massenspektrometrisch analysiert. Die deconvolierten Massenspektren zeigen die Phosphorylierung und O-Glycosylierung der Aa Untereinheit sowie die N Glycosylierung der Bb und g-Untereinheit. Außerdem wurden auf jeder Untereinheit single nucleotide polymorphisms beobachtet, welche zum Austausch einer Aminosäure führen. Durch Verdau mit Trypsin konnte die Identität des Fibrinogen und das Auftreten der SNPs bestätigt werden. Es zeigte sich aber auch, dass das isolierte Fibrinogen Verunreinigungen wie z. B. Albumin und Fibronectin enthält, welche allerdings bei der Flüssigkeitschromatographie abgetrennt werden und die Analyse der intakten Fibrinogenunterheiten nicht stören.
Es ist bekannt, dass die posttranslationalen Modifikationen von Proteinen in Krebszellen verändert sind. So ist zum Beispiel die Fucosylierung von Glycanstrukturen in Krebszellen erhöht. Deshalb wurden Proben von HCC Patienten, Zirrhosepatienten und gesunden Spendern untersucht, um Unterschiede im Glycosylierungs- und Phosphorylierungs¬muster von humanem Fibrinogen festzustellen. Die verschiedenen Glycoformen und Proteinspezies wurden durch Anpassung der theoretischen Isotopenmuster an das experimentelle, deconvolierte Spektrum quantifiziert. Die Ergebnisse wurden statistisch analysiert. Hierzu wurden univariate Varianzanalysen (ANOVA) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil sialylierter und fucosylierter Glycoformen der Bb und g-Untereinheit bei HCC Patienten im Vergleich zu gesunden Spendern erhöht ist. Der Anteil fucosylierter Glycoformen ist bei Zirrhosepatienten sogar noch höher als bei HCC Patienten. Außerdem ist der Anteil phosphorylierter Spezies bei HCC Patienten verringert. Der Anteil einer einzigen Glycoform oder Proteinspezies eignet sich allerdings nicht als Biomarker. Es wurde daher eine Methode entwickelt, die eine Kombination verschiedener Proteinspezies zur Unterscheidung von gesunden Spendern, HCC und Zirrhosepatienten verwendet. Hierzu wurden multivariate statistische Methoden wie die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die multivariate Varianzanalyse (MANOVA) verwendet. Hauptkomponentenanalyse und MANOVA wurden mit den vier wichtigsten Glycoformen und Proteinspezies durchgeführt. Die Hauptkomponentenanalyse verwendet keine Informationen über die zu trennenden Gruppen und liefert daher nicht das optimale Ergebnis. Es zeigte sich aber bereits eine gute Trennung zwischen den Proben von gesunden Spendern und HCC /Zirrhosepatienten. Mit der MANOVA, welche die Information über die zu trennenden Gruppen verwendet, konnte eine ausgezeichnete Trennung zwischen den Datenpunkten von gesunden Spendern, HCC und Zirrhosepatienten erreicht werden. Die Receiver operating-characteristic-Kurven ergaben ausgezeichnete area under¬¬-the curve Werte von 0.989 (HCC/Zirrhose vs. gesund), 0.898 (HCC) und 0.920 (Zirrhose). Zur Validierung der entwickelten Methode wurde ein zweiter Datensatz von Proben mit unbekanntem Status analysiert (blinded data set). Die Proben der HCC und Zirrhosepatienten konnten dabei sehr gut von denen gesunder Spender unterschieden werden. Eine Unterscheidung zwischen Proben von HCC und Zirrhosepatienten konnte allerdings nicht beobachtet werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die hier entwickelte Methode zur Detektion von Leberkrebs und Leberzirrhose geeignet ist. Es handelt sich um die erste Studie, welche multivariate Datenanalyse in Verbindung mit massen¬spektro¬metrischer Anaylse intakter Proteine verwendet, um Proben von Krebspatienten zu identifizieren. Aufgrund der einfachen und schnellen Vorgehensweise, hat diese Methode das Potential die Krebsfrüherkennung zu revolutionieren.
In einem zweiten Projekt wurde eine graphische Benutzeroberfläche für die dreidimensionale Kreuzkorrelation (3DCC) entwickelt. Die dreidimensionale Kreuzkorrelation dient der Berechnung reiner NMR Spektren aus einem chromatographisch nicht vollständig getrennten Substanzgemisch. Dabei werden NMR-Spektren und extracted ion-Chromatogramme mathematisch korreliert. Hierfür müssen die Rohdaten vorbereitet werden. Dies geschieht beispielsweise in MATLAB und bedarf fortgeschrittener Kenntnisse im Umgang damit. Um die dreidimensionale Kreuzkorrelation möglichst vielen Benutzern zugänglich zu machen, wurde ein Programm mit graphischer Benutzeroberfläche entwickelt, welches den Nutzer durch alle erforderlichen Schritte führt. Zum Zweck eines Testdatensatzes wurden die N-Glycane aus humanem Plasma mittels 3DCC analysiert. Dabei konnten saubere NMR Spektren von sieben N Glycanen erhalten werden. Anhand dieses Testdatensatzes wurde ein Tutorial für die entwickelte graphische Benutzeroberfläche verfasst. Diese wird die dreidimensionale Kreuzkorrelation für viele potentielle Benutzer anwendbar machen und zu einer Verbreitung der Methode beitragen.

A method for detection of liver cancer has been developed. Liver cancer is often diagnosed late and hence its 5 year survival-rate is very low. The main risk factor for liver cancer is cirrhosis, primarily caused by alcohol abuse, NASH (non alcoholic steatohepatitis) or viral hepatitis (HBV or HCV). Therefore, fast and easy methods for detection of liver cancer are of great medical interest.
Fibrinogen is dominantly synthesized in the liver and thus an optimal target for detection of liver diseases. The method developed here uses ethanol precipitation to purify fibrinogen form human plasma. The three fibrinogen subunits (Aa, Bb and g) are reduced, separated by liquid chromatography and analyzed by mass spectrometry. The deconvoluted mass spectra display phosphorylation and O-glycosylation of the Aa subunit and N Glycosylation of Bb and g-subunits. Furthermore, single nucleotide polymorphisms that lead to exchanges of an amino acid were found at all subunits. The identity of the fibrinogen and the presence of the SNPs were confirmed by tryptic digests. But it was also shown that the isolated fibrinogen contains impurities like albumin and fibronectin. However, these impurities are separated by liquid chromatography and do not interfere in the analysis of the intact fibrinogen subunits.
It is known that the posttranslational modifications of proteins are changed during cancer. For example fucosylation of glycan structures is increased in cancer cells. Therefore, samples of HCC patients, cirrhosis patients and healthy controls were analyzed to detect differences in the glycosylation and phorsphorylation pattern of human fibrinogen. The different glycoforms and protein species were quantified by fitting the theoretical isotopic patterns to the experimental deconvoluted spectra. The results were analyzed statistically. Univariate analyses of variance (ANOVA) show that the amount of sialylated and fucosylated glycoforms is increased in HCC patients compared to healthy donors. The amount of fucosylated glycoforms is even higher in cirrhosis patients. Furthermore, the amount of phosphorylated species is decreased in HCC patients. However, a single glycoform or proteinspecies cannot be used as a biomarker. Therefore, a method that uses a combination of different protein species for differentiation of healthy donors, HCC and cirrhosis patients was developed. For this purpose, multivariate statistical methods like principal component analysis (PCA) and multivariate analysis of variance (MANOVA) were used. Principal component analysis and MANOVA were performed with the four most important protein species. Since principal component analysis does not use information about the groups that are to be separated, it does not give the optimal results. It shows, however, a good separation between samples of healthy donors and HCC/cirrhosis patients. With MANOVA that uses the information about the groups, an excellent separation between healthy donors, HCC and cirrhosis patients was achieved. The area-under-the curve values of the receiver-operating-characteristic-curves were 0.989 (healthy vs. HCC/cirrhosis), 0.898 (HCC) and 0.920 (cirrhosis). For validation a second dataset containing samples of unknown status (blinded data set) was analyzed. Samples of HCC and cirrhosis patients could be distinguished from samples of healthy donors, but differentiation between HCC and cirrhosis samples is not yet possible.
It was shown that the method developed here is applicable for detection of liver cancer and liver cirrhosis. It is the first study that uses multivariate data analysis in conjunction with mass spectrometry of intact proteins to identify samples of cancer patients. Due to its fast and simple approach, this method could have great impact on cancer screening.
In a second project a graphical user interface for three dimensional cross correlation (3DCC) was developed. Three dimensional cross correlation calculates pure NMR spectra from a mixture of analytes that is not completely resolved by chromatography. Therefore, NMR spectra and extracted ion chromatograms are correlated mathematically. Data preparation is usually performed with MATLAB. For this, advanced knowledge in MATLAB programming is required. To make 3DCC applicable for more potential users, a program with a graphical user interface was developed that leads the user through all important steps of three dimensional cross correlation. As an example dataset, the N-glycans from human plasma were analyzed by 3DCC. Pure NMR spectra of seven N glycans were obtained. On the basis of this example dataset, a tutorial for the graphical user interface for 3DCC was written. This will make 3DCC applicable for more potential users and help to increase the methods publicity.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/7654
URN: urn:nbn:de:gbv:18-90980
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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