Functional characterization of Ceroid Lipofuscinosis Neuronal 3 (CLN3) interactions

Abstract

Die Juvenile Neuronale Ceroid Lipofuscinose (JNCL), auch “Morbus Batten” genannt, ist eine autosomale rezessive neurodegenerative Erkrankung bei Kindern. Die Akkumulation von autofluoreszentem Material in Lysosomen kennzeichnet diese. Hierbei sind verschiedene Organe betroffen, aber das am drastischsten betroffene Organ ist das Gehirn und neuronale Dysfunktionen charakterisieren die Erkrankung. JNCL wird durch Mutationen im Gen CLN3 hervorgerufen. Das kodierte Protein, CLN3, hat sechs Transmembran-Domänen und ist prädominant in späten endosomalen/lysosomalen Kompartimenten lokalisiert. Bis heute ist die Funktion von CLN3 unbekannt. In vorherigen Studien wurde Pen2 als Interaktionspartner von CLN3 identifiziert. Pen2 ist eine Untereinheit des γ-Sekretase Komplexes. Es wird angenommen, dass eine Dysfunktion der γ-Sekretase die Entstehung von Morbus Alzheimer begünstigen kann. Pen2 spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung, der Stabilisierung und dem intrazellulärem Transport des γ-Sekretase Komplexes. In dieser Arbeit wurde die Co-Lokalisation und Interaktion von unterschiedlich markierten Versionen von CLN3 und Pen2 in HeLa und COS-7 Zellen demonstriert. Weiterhin wurden isogene CLN3 und Pen2 knockout HeLa Zellen mit Hilfe des CRISPR/Cas9 Systems generiert, um die zelluläre Funktion beider Proteine zu untersuchen. Die phänotypische Charakterisierung beider knockout Zelllinien im Vergleich zu wild typ Zellen beinhaltete die Aktivität der γ-Sekretase. Die Prozessierung der bereits beschriebenen Substrate Amyloid Precursor Protein (APP) und Notch wurden analysiert. Wie erwartet, war die Prozessierung beider Substrate in Pen2 knockout Zellen inhibiert und dieser Phänotyp konnte durch die Expression von GFP-Pen2 aufgehoben werden. In CLN3 knockout Zellen war die Prozessierung von γ-Sekretase Substraten im Vergleich zu wild typ Zellen nicht verändert. Weitere Untersuchungen umfassten Veränderungen im lysosomalen-autophagosomalen System in beiden knockout Zelllinien im Vergleich zu wild typ Zellen. Lysosomale enzymatische Aktivitäten wurden analysiert und eine reduzierte β-Hexosaminidase A Aktivität in beiden knockout Zelllinien beobachtet. Weiterhin wurde eine Zunahme von Autophagosomen gefunden. Um diese Veränderungen zu evaluieren, wurden unterschiedliche Schritte des Autophagie-Pfads experimentell betrachtet. Dabei wurden Zellen mit Inhibitoren des mTOR Komplexes behandelt, mit einem Disaccharid, Trehalose, welcher mTor unabhängige Autophagie induziert und mit Inhibitoren der Autophagosomen-Lysosomen-Fusion. Die Inhibition des mTOR abhängigen Pfads führte zu keiner weiteren Akkumulation von Autophagosomen in CLN3 und Pen2 knockout Zellen. Im Kontrast dazu, zeigten CLN3 und Pen2 knockout Zellen einen eindeutigen Anstieg im Autophagosomen Level nach Induktion des mTOR unabhängigen Pfads durch Trehalose und nach Inhibition der Autophagosomen-Lysosomen-Fusion. Zusätzlich wurde in beiden knockout Zelllinien ein verringerter Autophagie-Flux nachgewiesen. Die Resultate dieser Arbeit weisen sehr deutlich darauf hin, dass die CLN3 und Pen2 Interaktion einer von der γ-Sekretase unabhängige Funktion unterliegt. Weiterhin verdeutlichen die hier durchgeführten Analysen zum ersten Mal, dass die Deletion von Pen2 lysosomale und autophagosomale Funktionen verändert. Zusätzlich sind die Ergebnisse im Einklang mit früheren Studien, welche für CLN3 eine funktionale Rolle in Lysosomen und Autophagosomen nahegelegt haben. Aufgrund des gemeinsamen Phänotyps und ihrer Interaktion könnten beide Proteine wichtig für die lysosomale Funktionalität sein. Eine Aufhebung dieser Interaktion scheint Veränderungen in der lysosomalen enzymatischen Aktivität und im Autophagie Pfad zu bedingen. Diese Effekte spielen möglicherweise bei der Entstehung sowohl von neurodegenerativen Erkrankungen des Kindesalters, wie JNCL, als auch von neurodegenerativen Erkrankungen Erwachsener, wie Morbus Alzheimer, ein Rolle.

Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis (JNCL) is an autosomal recessive neurodegenerative disease also known as Batten disease mainly affecting children. JNCL patients show accumulation of autofluorescent material in lysosomes. The disease affects several organs but the most drastically affected organ is the brain and neuronal dysfunctions characterize the disease. JNCL is caused by mutations in the gene CLN3. The encoded protein CLN3 is a six transmembrane protein and predominantly localized to late endosomal/lysosomal compartments. To date the function of a CLN3 is unknown. Pen2 has been previously identified as an interaction partner for CLN3. Pen2 is a subunit of the γ-secretase complex. Dysfunction of the γ-secretase is thought to underlie Alzheimer’s disease. The suggested function of Pen2 is allowing full assembly, stabilization and proper trafficking of the γ-secretase complex. In this thesis, co-localization and interaction of tagged versions of CLN3 and Pen2 were demonstrated in HeLa and COS-7 cells. Moreover, isogenic CLN3 and Pen2 knockout HeLa cells were generated by using the CRISPR/Cas9 system to investigate the cellular function of both proteins. The phenotypic characterization of both knockout cell lines in comparison to wild type cells included the activity of the γ-secretase. Processing of the well-known substrates amyloid precursor protein (APP) and Notch was analyzed. As expected, processing of both substrates was hampered in Pen2 knockout cell and this phenotype was rescued by overexpression of GFP-Pen2. In CLN3 knockout cells, processing of γ-secretase substrates was not altered and comparable to wild type cells. Further investigations comprised alterations in the lysosomal-autophagosomal system in both knockout cells as compared to wild type cells. Lysosomal enzymatic activities were analyzed and a reduced β-hexosaminidase A activity was observed in both knockout cell lines. Moreover, an increase in the level of autophagosomes was observed. To evaluate these changes, different steps of the autophagy pathway were challenged. To this end cells were treated with mTOR complex inhibitors, a disaccharide sugar, trehalose, that induces mTOR-independent autophagy and inhibitors of the autophagosomal-lysosomal fusion step. Inhibition of the mTOR-dependent pathway did not further induce autophagosomes accumulation in CLN3 and Pen2 knockout cells as compared to wild type cells. In contrast, CLN3 and Pen2 knockout cells clearly exhibited an increased level of autophagosomes after induction of the mTOR-independent pathway by trehalose and after inhibition of autophagosomal-lysosomal fusion. In addition, both knockout cell lines displayed decreased autophagic flux. In conclusion, the current data strongly suggests that CLN3 and Pen2 interaction has a γ-secretase independent function. In this thesis, it has been reported for the first time that Pen2 deletion cause changes in lysosomal and autophagosomal functions. In addition, the presented data is in agreement with previous reports suggesting a role for CLN3 in lysosomal function and in autophagy. Because of the shared phenotypes, the interaction of both proteins could be important for normal functioning of lysosomes. Disruption of this interaction is likely to cause alterations of lysosomal enzymatic activities and in the autophagy pathway. These effects may be involved in the development of both, childhood neurodegenerative diseases, such as JNCL and in adult neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease.