Charakterisierung der Interaktion des Herpes-Simplex-Virus Typ 2 Proteins ICP0 mit der zellulären E3 Ubiquitinligase SIAH-1 und deren Rolle für den viralen Infektionsverlauf

Abstract

Etwa 15-30% der Weltbevölkerung sind mit dem Herpes-Simplex-Virus Typ 2 (HSV2) infiziert. In den meisten Fällen infiziert HSV2 die Schleimhäute des Genitaltraktes und ist in der Lage nach einer Primärinfektion Latenz in den innervierenden Neuronen zu etablieren. Hierdurch persistiert das Virus ein Leben lang im Menschen und kann unter gewissen Bedingungen wieder reaktivieren. Bis heute gibt es keine Medikamente, die das Virus endgültig entfernen, oder Impfstoffe, die eine Erstinfektion verhindern. Die Mechanismen einer lytischen HSV Infektion und die Prozesse der Latenzetablierung und Reaktivierung sind multifaktoriell und nur unvollständig verstanden. Dem unmittelbar frühen viralen Protein ICP0 (Infected Cell Protein 0) wird bei diesen Prozessen eine wichtige Rolle zugesprochen, da es über seine E3 Ubiquitinligase Funktion in der Lage ist, die Abundanz einer Vielzahl an zellulären und viralen Proteine zu regulieren. Zu den Substraten, die von ICP0 für den proteasomalen Abbau markiert werden, gehören vor allem Bestandteile zellulärer Abwehrmechanismen, die an der Eindämmung der HSV Infektion beteiligt sind. Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass ICP0 von HSV2 mit dem humanen SIAH-1 (Seven in Absentia Homolog) Protein über hochkonservierte Konsensusmotive interagiert. SIAH-1 besitzt ebenfalls eine E3 Ubiquitinligase Funktion, über die es den proteasomalen Abbau seiner Zielproteine vermittelt. Transfektionsexperimente haben ergeben, dass SIAH-1 ICP0 bei der Interaktion polyubiquitiniert, ein Vorgang, der zum proteasomalen Abbau von ICP0 führt. SIAH-1 spielt unter anderem bei der Zellzyklus- und DNA-Reparatur-Regulierung eine Rolle. Da ICP0 und SIAH-1 an der Regulierung zum Teil identischer Signalwege beteiligt sind (und SIAH-1 verstärkt in Nervenzellen exprimiert wird), könnte eine Interaktion von SIAH mit ICP0 in verschiedenen Phasen der HSV2 Infektion wichtig sein. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Bedeutung der ICP0:SIAH-1 Interaktion im Kontext von replikationskompetentem HSV2. Zu diesem Zweck wurden Virusmutanten konstruiert, in deren ICP0 Protein die SIAH-Bindemotive durch Punktmutationen deletiert wurden. Um die Auswirkung der fehlenden ICP0:SIAH-1 Interaktion auf die lytische und latente Infektion zu untersuchen, wurde der Phänotyp der Mutanten in vitro und in einem okularen Mausmodell in vivo überprüft. Es zeigte sich, dass die SIAH-bindedefizienten HSV2 Mutanten in ihrem Wachstum gegenüber Wildtypvirus in vitro und in vivo deutlich attenuiert waren, und sich die DNA- und Proteinexpressionrate signifikant reduzierte. Im Tiermodell waren die Titer der SIAH-bindedefizienten Mutanten an Tag 5 nach der Infektion in den Trigeminalganglien (TG) und im Hirnstamm signifikant niedriger als die von Wildtyp-HSV2. Reaktivierungsexperimente an präparierten TG-Explantaten zeigten, dass die ICP0-Mutante in der Lage war, Latenz zu etablieren und mit der gleichen Effizienz wie das Wildtypvirus aus der Latenz zu reaktivieren. Die erreichten Virustiter der SIAH-bindedefizienten Konstrukte waren nach der Reaktivierung jedoch deutlich niedriger. Die hier erzielten Ergebnisse zeigen, dass die ICP0:SIAH-1 Interaktion für eine effiziente lytische Genexpression und Virusreplikation notwendig ist, bei der Reaktivierung per se jedoch keine Rolle spielt.

Herpes-Simplex-Virus Type 2 (HSV2) is a neurotropic human pathogen that has infected about 15-30% of the world’s population. HSV2 initially infects and replicates in epithelial cells of the genital tract and invades the nervous system by entering the innervating sensory neurons where life-long latency is established. So far, there are no antiviral therapies available that prevent HSV2 de novo infection or eradicate the virus from infected hosts. The processes of the lytic life-cycle, as well as latency establishment and reactivation are complex and only poorly understood. Upon de novo infection, the viral infected cell protein 0 (ICP0) is immediately expressed and interacts with various viral and cellular proteins which eventually leads to the proteasomal degradation of the latter. Thus, ICP0 plays a key role in the before mentioned processes. In transfected tissue culture models, it has previously been demonstrated that ICP0 interacts with the cellular E3 ubiquitin ligase SIAH-1 and that SIAH-1 targets ICP0 for proteasomal degradation. The effect of this virus-host interaction during the establishment of HSV2 infection has, as yet, not been elucidated. In order to analyse the role of the interaction in regard to lytic and latent infection, HSV2 ICP0 mutants, in which the SIAH-binding motives were inactivated by point mutations, were constructed. These mutants were consequently analysed in cell culture, as well as in vivo, using an ocular mouse model. It was confirmed that ICP0 of HSV2 interacts with SIAH-1 via two conserved PxAxVxP amino acid binding motifs. Subsequently, the SIAH-1 binding-deficient HSV2 mutants demonstrated an attenuated growth behavior and were impaired in DNA and protein synthesis in vitro and in vivo. As compared to wildtype virus, in vivo viral loads of SIAH-1 binding-deficient HSV2 mutants were significantly reduced in the trigeminal ganglia (TG) and the brain stem at day 5 post infection. The presented findings suggest that ICP0:SIAH-1 interplay is important for efficient HSV2 replication and gene expression. It was shown in reactivation assays of latently infected intact TG explants, that the SIAH-binding deficient HSV2 mutants were able to reactivate from latency with the same efficiency as wildtype virus, but only achieved reduced viral titers upon reactivation. These data suggested that the ICP0:SIAH-1 interaction is not required for reactivation from latency per se but rather for the efficient progression of in vivo infection.