Characterization of circulating microRNAs as potential biomarkers for dementia

Abstract

Aktuell gibt es keinen einzigen Parameter, der den hohen Anforderungen eines aussagekräftigen Biomarkers zur Diagnose von schwerwiegenden Formen von Demenzen wie der Alzheimer Krankheit entspricht. MikroRNAs sind kleine, nichtkodierende Ribonukleinsäuren, die die Aktivität von Genen regulieren und durch ihre positiven Eigenschaften vielversprechende Kandidaten als Biomarker in der Diagnostik und als mögliche Ziele für therapeutische Maßnahmen darstellen. In der vorliegenden kumulativen Dissertation fasse ich meinen Beitrag zu zwei Forschungsartikeln zusammen. Sie beschreiben die Charakterisierung von zirkulierenden mikroRNAs als alternative Biomarker für die Alzheimer Krankheit und frontotemporale Demenzen. In der ersten Veröffentlichung wurde zunächst ein breites Spektrum an verschiedenen mikroRNAs in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit von Alzheimer Patienten und einer heterogenen Kontrollgruppe mittels auf quantitativer PCR und Präamplifikation basierender Hochdurchsatz Technologie (TaqMan OpenArray, ABI) gemessen. Es hat sich herausgestellt, dass nur ein kleiner Teil der mikroRNAs nachgewiesen werden konnte, wobei der Anteil stark exprimierter und damit frequentierter Signale geringer war. Dementsprechend zeigte ein größerer Teil der Daten unvollständige Expressionslevel, wobei diese mit der Expressionsfrequenz stärker korrelierten. Relative Quantifizierung konnte eine Vielzahl differentiell regulierter mikroRNAs in der Alzheimer Gruppe nachweisen. Durch den explorativen „MoR“ Algorithmus konnten die abundanten Signale miR-1274a, miR-146a und miR-100 als reliable und die weniger abundanten Signale miR-505-5p, miR-4467, miR-766, miR-375, miR-708, miR-3622b-3p, miR-296, miR-219 und miR-103 als informative und mittels MANCOVA auch als statistisch signifikante Biomarker identifiziert werden. Interessant war, dass der Informationsgehalt einiger mikroRNA Biomarker Kandidaten im Vergleich zu den traditionellen Alzheimer Proteinbiomarkern Tau, pTau identisch und gegenüber Aβ42 sogar höher erschien. Die Kombination aus miR-100, miR-103 und miR-375 demonstrierte schließlich eine Klassifikationsrate von 96%, wobei Kontrollen und Alzheimer Patienten jeweils mit einer Genauigkeit von 96.4% und 95.5% korrekt klassifiziert werden konnten. Darüber hinaus wurde ein komplexes Korrelationsmuster von miR-146a mit Tau und Aβ42 identifiziert, wobei miR-146a eine mögliche Regulation der Alzheimer Pathogenese beigemessen wurde. Zusammenfassend ist der Nachweis von zirkulierenden mikroRNAs in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit mittels Hochdurchsatz PCR möglich, wobei die als potentielle Biomarker Kandidaten identifizierten mikroRNA vorsichtig zu bewerten sind, da die überwiegende Anzahl an mikroRNAs nur in geringen Mengen exprimiert sind. Basierend auf den Befunden und Limitierungen der ersten Studie als auch auf weiteren Literaturrecherchen wurde in einer Folgestudie 1) die Nachweismethode gewechselt (miRCURY, Exiqon) und auf eine Präamplifikation verzichtet, 2) die Anzahl der Proben auf 44 gesunde Kontrollen und je 48 Patienten mit Alzheimer und frontotemporaler Demenz erhöht, 3) verstärkt Qualitätskontrollen eingebaut und 4) zwei vergleichbare Panel von je 96 mikroRNAs in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit und auch im Blutserum gemessen. Insgesamt waren die Signale im Serum deutlich stärker exprimiert und damit im Vergleich zu denen in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit besser zu detektieren. Standardkurven und inter-assay Experimente zeigten, dass die miRCURY assays auch im niedrigen Bereich linear messen können, konsistent hohe Amplifikationseffizienzen besitzen und die Reproduzierbarkeit (Tag-zu-Tag) der Signale im Serum bei ~ 99% und in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit bei ~97% lag. Weitere Qualitätsmaßnahmen identifizierten Referenz-mikroRNAs zur Normalisierung und kontrollierten mögliche Verunreinigungen durch hämolytische Serumproben. Ein Ziel war es, den mikroRNA Pool von Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit und Blutserum zu vergleichen. Im Gegensatz zu anderen Proteinbiomarkern wie den Neurofilamenten, konnte global jedoch keine Assoziation zwischen Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit und Bluterserum beobachtet werden. Das Ergebnis einer Clusteranalyse legte nahe, dass das zirkuläre mikroRNA Profil stark dem in der Zelle ähnelt, wodurch intrazelluläre Veränderungen auch in Körperflüssigkeiten nachzuweisen wären. Während eine Faktorenanalyse der Serum Daten schließlich in einem komplexen 3-Faktor Modell resultierte, und gesunde Kontrollen mit hoher diagnostischer Güte klassifizierte, zeigten die mikroRNAs in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit eher moderate Unterschiede zwischen der Alzheimer Krankheit und den frontotemporalen Demenzen. Interessant war, dass ein erheblicher Teil der mikroRNAs des 3-Faktor Modells einerseits mit den Proteinkonzentrationen von Neurofilamenten und andererseits mit denen von Aβ42 aus der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit korrelierte (R2~20-40%). Insgesamt zeigen die Versuche, dass mikroRNAs im Serum und in der Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit als potentielle Biomarker Kandidaten für die Alzheimer Krankheit oder frontotemporale Demenzen fungieren können. Allerdings sind weitere Studien, mit größeren Kohorten und strengeren Qualitätskontrollen notwendig, um die Reliabilität und Reproduzierbarkeit der Daten als auch ihre Vergleichbarkeit im Feld zu verbessern und zu gewährleisten.

Currently, there is not a single parameter that meets the high requirements of a reliable biomarker to diagnose severe forms of dementia, such as Alzheimer's disease. MicroRNAs are small, noncoding ribonucleic acids that regulate the activity of genes and, through their beneficial properties, are promising candidates as biomarkers in diagnostics and as potential targets for therapeutic intervention. In this cumulative dissertation I summarize my contribution to two research articles. They describe the characterization of circulating microRNAs as alternative biomarkers for Alzheimer's disease and frontotemporal dementias. In the first publication, a broad range of different microRNAs was measured in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients and a heterogeneous control group by means of pre-amplification-based quantitative PCR high-throughput technology (TaqMan OpenArray, ABI). It became clear that only a small part of the microRNAs could be detected, whereby the proportion of strongly expressed and thus frequented signals was lower. Accordingly, a greater portion of the data showed incomplete expression levels, which correlated more strongly with the expression frequency. Relative quantitation identified a variety of differentially regulated microRNAs in the Alzheimer’s group. Using the exploratory "MoR" algorithm, the abundant signals miR- 1274a, miR-146a, and miR-100 were found to be reliable and the less abundant signals miR-505-5p, miR-4467, miR-766, miR-375, miR-708, miR-3622b-3p, miR-296, miR- 219 and miR-103 were identified as informative and by means of MANCOVA also as statistically significant biomarkers. Interestingly, the degree of information of some microRNA candidate biomarker was identical to that of the traditional Alzheimer protein biomarkers tau, pTau and even higher compared to Aβ42. The combination of miR-100, miR-103 and miR-375 finally demonstrated a classification rate of 96%, whereby controls and Alzheimer's patients were correctly classified with an accuracy of 96.4% and 95.5%, respectively. In addition, a complex correlation pattern of miR-146a with Tau and Aβ42 was identified, suggesting miR-146a to be involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease. In summary, the study showed that the detection of circulating microRNAs in the cerebrospinal fluid by high-throughput PCR is possible but careful consideration should be given to the microRNAs identified as potential biomarker candidates, since the majority of microRNAs are expressed only in small amounts. Based on the findings and limitations of the first study as well as on further literature research, in the follow-up study I 1) changed detection chemistry (miRCURY, Exiqon) and profiled miRNAs without pre-amplification, 2) increased the number of samples to 44 healthy controls and 48 patients with Alzheimer's disease and frontotemporal dementia, 3) incorporated improved quality controls and 4) measured two comparable panels of 96 microRNAs each in cerebrospinal fluid and also in serum. Overall, the signals were significantly more expressed in the serum and thus better to detect in comparison to those in cerebrospinal fluid. Standard curves and inter-assay experiments showed that the miRCURY assays also measured linearly towards the low range, have consistently high amplification efficiencies, and the day-to-day reproducibility of the signals in serum was ~ 99% and in cerebrospinal fluid ~ 97%, respectively. Further quality measures identified reference microRNAs for normalization and controlled potential contamination by hemolytic serum samples. One goal was to compare the microRNA pool of cerebrospinal fluid and blood serum. In contrast to other protein biomarkers such as neurofilaments, however, no association could be observed globally between microRNA expression levels in cerebrospinal fluid and serum. The result of a cluster analysis suggested that the circular microRNA profile closely resembles that in the cell, which would enable and support the detection of intracellular changes also in body fluids. While factor analysis of serum data ultimately resulted in a complex 3-factor model classifying healthy controls with superior performance, the cerebrospinal fluid microRNAs displayed rather moderate differences between Alzheimer's disease and frontotemporal dementias. Interestingly, a significant portion of microRNAs from the 3-factor model correlated on the one hand with cerebrospinal fluid protein levels of neurofilaments and on the other hand with those of Aβ42 (R2~20-40%). Overall, the experiments show that microRNAs in serum and CSF can are promising biomarker candidates for Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. However, further studies, with larger cohorts and stricter quality controls, are needed to improve and ensure the reliability and reproducibility of the data as well as their comparability in the field.