The role of SUMO modification during productive adenovirus infection and the identification of PIAS4 as a transcriptional repressor of early adenoviral genes

Abstract

The human adenovirus type 5 E1B-55K protein is a multifunctional protein that promotes viral replication and E1-mediated transformation of primary cells in cell culture. It has been shown that the functions of E1B-55K are tightly regulated through its posttranslational modification with the small ubiquitin related modifier (SUMO). In addition, E1B-55K exploits the host cell SUMO machinery by functioning as a SUMO E3 ligase. In this context, we and others revealed that E1B-55K induces SUMOylation of p53 and probably Sp100A, thereby inactivating these host restriction factors and ensuring a productive infection. In a comprehensive stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) analysis we found that adenovirus wildtype infection globally induces the conjugation of SUMO2 proteins. Intriguingly, we identified 78 cellular proteins, which were E1B-55K-dependently SUMOylated during the course of infection, indicating that its SUMO E3 ligase activity is likely not restricted to p53 and Sp100A. Moreover, we found that a considerable number of adenoviral early and late proteins is SUMO modified during infection, among them the adenoviral Bcl-2 homologue E1B-19K. E1B-19K plays an important role in the inhibition of p53-independent induced apoptosis by counteracting the pro-apoptotic mediators Bax and Bak. HAdV-C5 E1B-19K contains two potential SUMO consensus motifs (SCM); one at lysine 44, which is highly conserved among different HAdV species, and a less conserved one at lysine 48. In this work, we aimed to elucidate the biological relevance of SUMOylation for E1B-19K. Therefore, we intended to confirm its posttranslational modification with SUMO in different experimental approaches, and in parallel, functionally characterize plasmid and virus SUMO mutants of E1B-19K. Mutation of E1B-19K SCMs showed no significant phenotype in terms of subcellular localization, protein stability and altered virus growth, but significantly increased the transforming potential of E1B-19K in primary baby rat kidney (pBRK) cells. In order to investigate cellular factors, which regulate the SUMOylation of E1B-55K, we overexpressed the viral protein with different cellular SUMO E3 ligases of the protein inhibitor of activated STAT (PIAS) family. Besides regulating SUMOylation, these proteins are potent transcriptional regulators that interact with a plethora of transcription factors. Here we found for the first time that E1B-55K protein levels are remarkably repressed in the presence of overexpressed PIAS4. We could exclude that the E1B-55K levels were repressed due to enhanced direct SUMOylation. Further, we revealed PIAS4 as a novel host restriction factor of adenoviral infection that putatively acts by repressing the E1B-promoter activity in a dose-dependent manner. This resulted in reduced E1B-55K mRNA and protein levels upon coexpression of the E1-gene region with PIAS4. Interestingly, we could show that the promoter repression is most likely not restricted to the E1B-promoter as E1A mRNA and protein levels were also found to be remarkably reduced. Accordingly, overexpression of PIAS4 led to impaired E1-mediated transformation of pBRK cells. Contrary, high levels of PIAS4 showed rather mild repressive effects on viral mRNA levels and protein expression during HAdV infection without having significant effect on virus progeny production. This implicates a role of an immediately present adenoviral factor during infection in counteracting PIAS4-mediated virus restriction. We showed that this is partially dependent on the SUMO E3 ligase function of PIAS4 which is involved in the repression of viral protein levels. Thus, counteracting PIAS4-mediated SUMOylation might be one mechanism through which adenovirus evades repression of PIAS4.

Das adenovirale Protein E1B-55K trägt durch die Unterdrückung der intrinsischen anti-viralen Immunantwort und dem Aufrechterhalten der Zellproliferation der infizierten Wirtszelle wesentlich zu einer effizienten Infektion bei. Für eine Vielzahl dieser Mechanismen nutzt E1B-55K wirtseigene posttranslationale Modifikationen (PTM) wie z. B. Ubiquitinylierung und SUMOylierung. Dabei wird E1B-55K selbst über SUMO Konjugation reguliert und fungiert zugleich als eine SUMO E3 Ligase. Mit Hilfe von stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) konnten wir zeigen, dass E1B-55K einen deutlichen Effekt auf die globale Anzahl der zellulären SUMO2-konjugierten Proteine während der Wildtyp Infektion hat. Zahlreiche zelluläre Proteine, die in Abhängigkeit von E1B-55K höher SUMOyliert wurden, sind an der Reparatur von DNA Schäden, der transkriptionellen Regulation, der Zellzyklus Kontrolle und der RNA Prozessierung beteiligt. Des Weiteren haben wir gezeigt, dass neben E1B-55K eine beachtliche Anzahl weiterer viraler Proteine während der Infektion SUMOyliert wird, darunter das Apoptose-inhibierende E1B-19K Protein. Dieses frühe virale Protein verhindert die Induktion p53-unabhängiger Apoptose, indem es die pro-apoptotischen Proteine Bax und Bak bindet, und dadurch deren Porenbildung in der mitochondrialen Membran verhindert. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir die SUMOylierung von E1B-19K mit verschiedenen Methoden untersucht. Außerdem wurde die biologische Relevanz dieser PTM anhand verschiedener E1B-19K SUMO Mutanten in der Transfektion und Infektion charakterisiert. Dabei konnten wir zeigen, dass die Mutation der Lysine innerhalb der SUMO Konsensus Motive (engl. SCM) das transformierende Potential von E1B-19K in Primärzellen neugeborener Ratten signifikant erhöht, jedoch keine Auswirkung auf die zelluläre Lokalisation und Protein Stabilität von E1B-19K hat und auch das Wachstum einer Virusmutante nicht beeinträchtigt. Zur genaueren Untersuchung der für die SUMOylierung von E1B-55K zuständigen zellulären SUMO E3 Ligase wurde E1B-55K mit verschiedenen Isoformen der protein inhibitor of activated STAT (PIAS) Proteinfamilie koexprimiert. PIAS Proteine regulieren die Transkription zellulärer Gene und besitzen eine SUMO E3 Ligase Funktion. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir erstmalig zeigen, dass ausschließlich humanes und murines PIAS4 die Proteinkonzentration von E1B-55K deutlich reduziert. Des Weiteren geht die Reduktion von E1B-55K nicht mit einer erhöhten SUMOylierung durch PIAS4 einher, sondern die Aktivität des E1B-Promotors wird durch die transkriptionelle Regulation von PIAS4 reprimiert. Dies führt zur Reduktion der E1B-55K mRNA- und Proteinmengen. Neben E1B-55K wird der E1A-Promoter durch eine erhöhte Expression von PIAS4 reprimiert. Dies könnte zur gezeigten erniedrigten Expression der E1-Gene führen, welche das transformierende Potential der E1-Proteine in Primärzellen von neugeborenen Ratten in der Anwesenheit von überexprimiertem PIAS4 stark einschränkt. Während der Infektion hat überexprimiertes PIAS4 nur einen schwach repressiven Effekt auf die virale Proteinexpression und die Synthese neuer infektiöser Viruspartikel. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein viraler Faktor während der initialen Phase der Infektion PIAS4 inaktiviert, wodurch eine produktive Infektion gewährleistet wird. Eine virus-vermittelte Inhibition der SUMO E3 Ligase Aktivität von PIAS4 könnte in diesem Zusammenhang ein möglicher Wirkmechanismus sein, wie Adenoviren der Repression von PIAS4 während der Infektion entgegenwirken, da wir zeigen konnten, dass die enzymatische Aktivität von PIAS4 teilweise in der transkriptionellen Repression der viralen E1-Gene involviert ist.