Epigenetic mechanisms of transcriptional regulation in cardiac hypertrophy using engineered heart tissue

Abstract

In recent years, DNA methylation has gained increasing attention as a regulator of gene transcription, but its role in heart disease is not well understood. To better characterize the function of DNA methylation in cardiomyocytes under physiological and stress conditions, the main cardiac DNA methyltransferase isoform, DNMT3A, was knocked out in human induced pluripotent stem cells (hiPSC) by CRISPR/Cas9 gene editing at the heterozygous, homozygous and compound heterozygous state, allowing the establishment of gene-dose relationships. The consequences of the knockout were analyzed in engineered heart tissues (EHT) generated from knockout hiPSC-derived cardiomyocytes in comparison to control EHTs from isogenic wildtype cells under baseline and pro-hypertrophic treatment conditions. Knockout of DNMT3A had no effect on differentiation of hiPSC into the cardiac lineage, yielding beating cardiomyocytes at high purity. Functional analysis revealed significantly faster relaxation kinetics and shortened action potentials in knockout EHTs compared to controls and significant functional degradation as well as arrhythmias after three weeks of culture. Hypertrophic intervention by treatment of EHTs with phenylephrine and endothelin-1 for 7 days, as expected, reduced contractile force in auxotonically contracting control EHTs, while it increased contractile force in knockout EHTs, reaching values of control EHTs in the absence of hypertrophic agonists. Molecular analysis revealed significant hypomethylation in knockout compared to controls. Several genes with low expression in control cardiomyocytes were upregulated in the absence of DNMT3A, suggesting direct regulation of those genes by DNA methylation. Among these genes were several potassium currents, possibly accounting for shorter action potentials and abbreviated relaxation, and the transcription factor peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARy), normally regulating fat metabolism in adipocytes and hepatocytes. In accordance with the latter, histological analysis revealed accumulation of lipid droplets in the knockout cardiomyocytes. Hypertrophic treatment of knockout EHTs prevented both the upregulation of PPARy and the accumulation of lipids, suggesting a causal link between upregulation of PPARy, lipid accumulation, and functional degradation of the knockout EHTs.

Die regulatorischen Funktionen der DNA-Methylierung haben in den letzten Jahren zunehmend Beachtung gefunden. Ihre genaue Rolle in Herzkrankheiten ist dennoch bisher weitgehend ungeklärt. Die DNA-Methyltransferase DNMT3A, die wichtigste Isoform in Kardiomyozyten, wurde mit Hilfe von CRISPR/Cas9-Geneditierung in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeschaltet. Aus hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten wurde dann künstliches Herzgewebe (engineered heart tissue, EHT) zur Untersuchung der Funktion der DNA-Methylierung unter Kontroll- und Stressbedingungen generiert. DNMT3A-Defizienz hatte keinen Einfluss auf die Differenzierung der hiPSC, sodass schlagende Kardiomyozyten generiert werden konnten. Auf funktioneller Ebene führte die Abschaltung von DNMT3A zu schnellerer Relaxation der EHTs im Vergleich zu Kontrollen, zu verkürzten Aktionspotentialen, sowie einer funktionellen Degeneration der EHTs mit zunehmenden Arrhythmien nach drei Wochen in Kultur. Behandlung von Kontroll-EHTs mit den pro-hypertrophen Substanzen Phenylephrin und Endothelin-1 führte wie erwartet zu einer Abnahme der Kontraktilität, wogegen in den methylierungsdefizienten EHTs die funktionelle Degeneration durch die Behandlung verhindert wurde. In der molekularen Analyse war eine signifikante Hypomethylierung in den DNMT3A-defizienten EHTs im Vergleich zu Kontroll-EHTs sowie eine hohe Expression mehrerer Gene, die in Kontroll-Kardiomyozyten nur gering exprimiert waren, zu beobachten. Dies legte eine direkte Regulation der entsprechenden Gene durch DNA Methylierung nahe. Neben Ionenkanälen, deren Hochregulation an der beschleunigten Relaxationskinetik der DNMT3A-defizienten EHTs beteiligt sein könnten, war eines der besagten Gene der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor Gamma (PPARy). Dieser ist normalerweise an der Regulation des Fett-Metabolismus in Adipozyten und Hepatozyten beteiligt. Im Einklang mit dieser Beobachtung zeigte sich in einer histologischen Analyse eine Akkumulation von Fetteinlagerungen in Kardiomyozyten in DNMT3A-defizienten EHTs. Die pro-hypertrophe Behandlung der EHTs verhinderte sowohl die höhere Expression von PPARy, als auch die Einlagerung des Fettes, was auf einen kausalen Zusammenhang zwischen höherer PPARy Expression, Fetteinlagerungen und der funktionellen Degeneration der EHTs hinweisen könnte.