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Titel: Regulation, Struktur und zelluläre Lokalisation von Proteinen der Fettsäureelongation in Zea mays L.
Sonstige Titel: Regulation, structure and cellular localisation of proteins involved in the fatty acid elongation in Zea mays L.
Sprache: Deutsch
Autor*in: Littek, Marco
Schlagwörter: KCS; fatty acid elongation; FAE; glossy
GND-Schlagwörter: Fettsäuren; Fettsäurestoffwechsel; Fettsäure-Synthese; Fettsäurederivate; Lipide; Lipidstoffwechsel; Ketoacyl-CoA-Synthase <beta->; Mais
Erscheinungsdatum: 2004
Tag der mündlichen Prüfung: 2004-12-17
Zusammenfassung: 
Die Oberfläche von Pflanzen ist mit einer Cuticula bedeckt, welche aus in einem Cutin-Polymer eingelagerten amorphen intracuticulären Wachsen gebildet wird. Der Cuticula aufgelagert ist eine epicuticuläre Wachsschicht, welche zusammen mit der Cuticula eine wichtige Schutzbarriere vor übermäßiger Transpiration und UV-Strahlung bildet sowie eine Rolle bei der Pathogenabwehr und der Signalerkennung einnimmt.
Cuticuläre Wachse bestehen hauptsächlich aus langkettigen aliphatischen Komponenten, die aus sehr langkettigen Fettsäuren (VLCFAs = very long chain fatty acids) und ihren Derivaten synthetisiert werden. In den Plastiden werden zunächst in der Fettsäuresynthese (”fatty acid synthase“ = FAS) C16- und C18-Fettsäuren hergestellt. Die Elongation zu sehr langkettigen Fettsäuren (C24-C34) erfolgt im Cytoplasma vermutlich an der ER- oder der Zellmembran durch Enzyme der Fettsäureelongation (”fatty acid elongation“ = FAE).
Jeder Verlängerungsschritt der Acyl-CoAs umfasst sowohl bei der Fettsäuresynthese als auch der Fettsäureelongation vier Enzymreaktionen (Kondensation, Reduktion, Dehydratation und erneute Reduktion). Für die Enzyme der FAE wird im Gegensatz zu den Enzymen der FAS, welche separat als lösliche homodimere Proteine im Stroma der Plastiden vorkommen, eine membranständige Komplexstruktur vermutet. Der strukturelle Aufbau dieser Enzyme ist jedoch fast noch gänzlich unbekannt.
Die β-Ketoacyl-CoA-Synthase, welche jeweils den Kondensationsschritt katalysiert, gilt als das Hauptenzym der FAE und ist für die Substratspezifität sowie Umsatzrate verantwortlich. Die drei anderen Enzyme der FAE sind vermutlich für jeden Elongationsschritt identisch. Die KCS-Gene stehen daher meist im Mittelpunkt der Forschung und werden auch in der vorliegenden Arbeit schwerpunktmäßig bearbeitet.
In dieser Arbeit wurde das Ziel verfolgt, mehr über die Regulation des FAE-Komplexes aus Zea mays herauszufinden. Um einen Beitrag zur Aufklärung der Regulation des FAE-Komplexes auf der Protein-Ebene zu leisten, wurden Twohybrid-Assays mit der beta-Ketoacyl-CoA-Synthase-1 aus Zea mays (ZmKCS-1) durchgeführt, um mögliche Interaktionspartner für das Protein zu isolieren bzw. schon bekannte Proteine der FAE als Bindungspartner von ZmKCS-1 zu testen. Hierzu gehört glossy8, dessen Genprodukt als beta-Ketoacyl-CoA-Reduktase identifiziert werden konnte und damit einen potentiellen Interaktionspartner von ZmKCS-1 darstellt. In den Twohybrid-Versuchen sollte außerdem eine mögliche Membranständigkeit von ZmKCS-1 und putativen Komplexpartnern untersucht werden.
Eine genauere Analyse zur Lokalisation von ZmKCS-1 und möglichen Komplexpartnern sollte durch GFP-Studien erfolgen.
Für die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen wurde mit Hilfe eines Gal4-Hefe-Twohybrid-Systems und ZmKCS-1 als Köderprotein eine cDNA-Bank aus unreifen männlichen Blüten nach potentiellen Interaktionspartnern durchmustert. Durch einen solchen Screen konnte der putative Bindungspartner PRP23 (PRP = prolinreiches Protein) isoliert werden. Durch weitere Twohybrid-Versuche konnte dieser als Bindungspartner von ZmKCS-1 bestätigt werden. Die Analyse von PRP23 zeigte, dass es sich um ein relativ kleines Protein von ~ 20 kDa handelt, welches am N-Terminus eine stark hydrophobe Region und im C-terminalen Bereich einen auffälligen prolinreichen Abschnitt aufweist. Außerdem konnte durch Versuche mit einem membranbasierten Twohybrid-System gezeigt werden, dass PRP23 vermutlich eine ungerade Anzahl von Transmembrandomänen besitzt (wahrscheinlich eine oder drei) und mit dem C-Terminus in das Cytoplasma ragt. PRP23 könnte möglicherweise eine Rolle beim Lipidtransport von der ER-Membran zur Plasmamembran bis zur Zellwand oder beim Aufbau des FAE-Komplexes wahrnehmen.
Mit Hilfe des membranbasierten Twohybrid-Systems konnte auch für ZmKCS-1 eine ungerade Anzahl von Transmembrandomänen nachgewiesen werden (vermutlich drei oder fünf), wobei das Protein mit dem C-terminalen Ende in das Cytoplasma hineinragt. Außerdem konnte in diesen Tests eine Homodimerisierung von ZmKCS-1 festgestellt werden. Eine solche Proteinkonstellation ist interessant, da die in ihrer Funktion und Struktur ähnlichen Enzyme der Fettsäuresynthese (FAS) ebenfalls Homodimere ausbilden.
Glossy8 konnte in den Twohybrid-Assays nicht als Interaktionspartner von ZmKCS-1 bestätigt werde. Möglicherweise sind mehr Proteine für das strukturelle Zusammenwirken dieser Enzyme nötig.
In dieser Arbeit durchgeführte GFP-Analysen mit PRP23 konnten keine eindeutige Aussage über die Lokalisation dieses Proteins erbringen. Es könnte jedoch membranständig sein, worauf seine hydrophobe Domäne im N-terminalen Bereich als auch die Interaktionsereignisse zwischen ZmKCS-1 und PRP23 im membranbasierten Twohybrid-System hinweisen.
ZmKCS-1 konnte durch Lokalisations-Experimente eindeutig dem Endoplasmatischen Retikulum zugeordnet werden, wo es vermutlich in der Membran lokalisiert ist.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/815
URN: urn:nbn:de:gbv:18-23283
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Wienand, Udo (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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