Trinucleotide Repeats (TNRs) : DNA-Bindungssubstrate für Wildtyp und mutiertes p53 und Modulatoren der p53-abhängigen Transkription

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die nicht-sequenz-spezifischen DNA-Bindungseigenschaften des Tumorsuppressor-Proteins p53 zu charakterisieren und den Einfluss von strukturierter DNA auf die wtp53-abhängige Transkription zu untersuchen. Als Modellsubstrate für die nicht-sequenz-spezifische DNA-Bindung dienten Trinucleotide Repeats (TNRs). TNRs entsprechen nicht der p53-Konsensus-Sequenz und sind aufgrund der quasi-palindromen repetitiven DNA-Sequenz in der Lage, durch intramolekulare Basenpaarung DNA-Hairpins mit fehlgepaarten Nukleotiden auszubilden. Zunächst wurden die nicht-sequenz-spezifischen DNA-Bindungseigenschaften von wt und mutp53 gegenüber TNRs in Abhängigkeit von der DNA-Konformation in vitro mit Hilfe von Bandshift-Analysen bestimmt und der Einfluss des C-Terminus auf die Interaktion ermittelt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die nicht-sequenz-spezifische DNA-Bindung sowohl von der DNA-Konformation als auch von der Konformation der DNA-Bindungsdomäne von p53 abhängt, und die Bindung durch den C-Terminus reguliert wird. Die Charakterisierung der TNR-Sekundärstrukturen und DNase I-Protektionsexperimente mit wtp53 und der DNA-Kontaktmutante R273H ergaben, dass einzelsträngige DNA-Bereiche wichtige Erkennungsmotive für die Bindung darstellen. Darüber hinaus konnte die Bindung von wtp53 und mutp53 R273H an TNRs in vivo durch Chromatin-Immunpräzipitation bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Abhängigkeit der wtp53-vermittelten Transkription des mdm2-Promotors von der DNA-Konformation in vivo untersucht. Dazu wurden TNRs in den Kontext des wtp53-spezifischen humanen mdm2-Promotors (P2) kloniert und der Einfluss von TNRs auf die Promotoraktivität analysiert. Da der humane mdm2-Promotor in Abhängigkeit der DNA-Topologie reguliert wird, wurden zunächst die sequenz-spezifischen DNA-Bindungseigenschaften von wtp53 gegenüber den beiden p53-Bindungsstellen mittels Bandshift-Analysen und DNase I-Protektionsexperimente in vitro charakterisiert. Dabei weist wtp53 gegenüber den beiden Bindungsstellen in linearer bzw. strukturierter DNA-Konformation unterschiedliche Bindungsaffinitäten auf. In vivo moduliert die erste Bindungsstelle in Abhängigkeit der DNA-Topologie die Transaktivierung des Promotors. Schließlich konnte durch Kompetitionsexperimente und 2D-Agarosegelelektrophorese gezeigt werden, dass TNRs spezifisch die wtp53-abhängige Transkription durch die Ausbildung von DNA-Strukturen in vivo beeinflussen.

The aim of the thesis was to characterize the non-sequence-specific DNA-binding properties of the tumorsuppressor protein p53 and to determine the influence of structured DNA on wtp53-mediated transcription. Trinucleotide repeats (TNRs) served as model-substrates to study non-sequence-specific DNA-binding, because they do not match the p53-consensus-sequence, and because their quasi-palindrome repetitive DNA-sequence enables them to form DNA-hairpins through intramolecular base pairing with mismatched nucleotides. In a first step I determined the non-sequence-specific DNA-binding properties of wt and mutp53 with TNRs depending on the DNA-structure in vitro by EMSA, and the influence of the C-terminus on this interaction. I could show that non-sequence-specific DNA-binding depends on DNA-conformation as well as on conformation of the DNA-binding domain of p53, and that the binding is regulated by the C-terminus. Characterization of the secondary structure of TNRs and DNase I footprinting with wtp53 and the DNA-contact mutant R273H revealed that single-stranded DNA regions represent important targets for the binding. Binding of wtp53 and mutp53 R273H to TNRs was also confirmed by chromatin-immunoprecipitation in vivo. In a second step the impact of DNA-conformation on wtp53-mediated transcription of the mdm2-promoter was analyzed in vivo. Therefore TNRs were cloned within the context of the wtp53-specific human mdm2-promoter (P2), and the influence of TNRs on the activity of the promoter was determined. Because regulation of the human mdm2-promoter depends on DNA-topology, I first characterized the sequence-specific DNA-binding properties of wtp53 to the two p53-binding-sites within this promoter by EMSA and DNase I footprinting in vitro. Wtp53 exhibited different affinities to the binding-sites in linear and structured conformation. In vivo, the first binding-site modulates transactivation of the promoter by DNA-topology. Finally I could show by competition experiments and 2D-agarose gel electrophoresis that TNRs influence the wtp53-mediated transcription by forming DNA-structures in vivo.