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Titel: In vitro processing and complex formation of coronavirus polyprotein NSP7-10 region
Sonstige Titel: In vitro Prozessierung und Komplexformation der NSP7-10 Region von Coronaviren
Sprache: Englisch
Autor*in: Krichel, Boris
Schlagwörter: Native Massenspektrometrie; Hydrogen-Deuterium Austausch; Nicht-struktur proteine; Native MS; Hydrogen-deuterium exchange; Non-structural proteins
GND-Schlagwörter: Massenspektrometrie; Virologie; Coronaviren; Strukturbiologie; Prozessierung; Multiproteinkomplex
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-07-26
Zusammenfassung: 
Coronaviruses (CoV) infect a wide range of species and can cause severe zoonotic disease in humans. The CoV polyproteins 1a and 1ab require processing to release non-structural proteins (NSPs) 1-11 and NSP 1-16 and form a replication transcription complex (RTC). It has been shown that two essential steps are (1) processing of the conserved polyprotein NSP7-10 region by main protease Mpro and (2) subsequent complex formation of the released NSPs. In this thesis, I analyzed processing and complex formation of the coronavirus NSP7-10 region with structural mass spectrometry.
In a first set of experiments, I studied processing of CoV NSP7-10. In the beginning, specific Mpro cleavage efficiencies were determined from FRET peptide substrates representing the SARS-CoV cleavage sites NSP7-10. Then, relative cleavage efficiencies were exposed, combining in vitro processing of SARS, 229e and FIP full-length protein substrates. The results show that within full-length substrates there is only limited conservation of cleavage efficiency and thereby oppose findings from peptide assays, of me here, and other researchers before.
In a second set of experiments, I provided novel insight into previously known and unknown NSP7+8 complexes of different CoV species. Initially, their landscape of non-covalent interactions was pictured by native MS. The predominant complexes found were FIP and TGEV-CoV hetero-trimeric NSP7+8 (2:1) and SARS, PEDV and 229e-CoV hetero-tetrameric NSP7+8(2:2). Thereon, gas-phase dissociation was tested with CID in Q-TOF tandem MS. The results suggest that tetramers of SARS have a different subunit arrangement than PEDV and 229e-CoV. Furthermore, the dissociations of FIP and TGEV-CoV were strikingly similar. From these results, a predicted model of the TGEV-CoV trimer was confirmed.
In a third set of experiments, I used high-mass MALDI MS for a different view on these processes. By revisiting in vitro processing of 229e NSP7-10, some open questions could be clarified. Carrying out MALDI-MS upon cross-linking of FIP and 229e-CoV NSP7+8, a similar complex landscape was observed as in native MS. In a fourth and last experiment, I compared uncleaved and cleaved TGEV-CoV NSP7-8 in HDX-MS. Clear differences in deuterium uptake in specific regions, indicated for tremendous structural rearrangement upon processing. Visualizing the results on structural models enhanced our understanding of binding sites in the complex and explained features of the polyprotein.
Summing up, multiple molecular processes upon processing of NSP7-10 were studied with structural MS. The CoV species vary in NSP7-10 cleavage sites efficiency and NSP7+8 complex architecture. These results provided new insights in protein interactions, which previously had been shown essential, and therefore could be helpful to develop antivirals.

Coronaviren (CoV) infizieren unterschiedliche Spezies und verursachen schwere Anthropozoonosen im Menschen. Die CoV Polyproteine 1a/ab müssen prozessiert werden, um 11/16 Nichtstruktur-proteine (NSPs) freizugeben, die am Replikations-Transkriptions Komplex (RTC) beteiligt sind. Zwei essentielle Schritte dorthin sind (1) die Prozessierung der konservierten Region NSP7-10 von der Protease Mpro und (2) die daraufhin ausgelöste Komplexbildung der freigegebenen NSPs. In dieser Arbeit analysierte ich Prozessierung und Komplexbildung der CoV NSP7-10 Region mit Methoden der strukturellen Massenspektrometrie (MS).
In einer ersten Reihe von Experimenten untersuchte ich die Prozessierung von SARS-CoV NSP7-10. Zu Beginn wurden Mpro Spalteffizienzen mit FRET Peptid Substraten, mit analogen Spaltstellen zu SARS NSP7-10, bestimmt. Dann wurden relative Spalteffizienzen offengelegt, in einem Verfahren, das in vitro Prozessierung von SARS, 229e und FIP-CoV Volllängensubstraten mit nativer Massenspektrometrie kombiniert. Die Ergebnisse zeigen, dass es zwischen den Volllängensubstraten nur begrenzte Konservierung von Spalteffizienz gibt und wiedersprechen daher Peptid Analysen, die hier von mir und bereits vorher von anderen Wissenschaftlern durchgeführt wurden.
Mit einer zweiten Reihe von Experimenten erbrachte ich neue Erkenntnisse über bereits bekannte und noch unbekannte NSP7+8 Komplexe. Anfangs wurde das Muster ihrer nicht-kovalenten Interaktionen mit nativer MS abgebildet. Darin waren die prädominierenden Komplexe FIP und TGEV-CoV Hetero-Trimer NSP7+8 (2:1) und SARS, PEDV und 229e-CoV Hetero-Tetramer NSP7+8(2:2). Daraufhin wurden deren Gasphasendissoziationen mit kollisionsinduzierter Dissoziation mit Q-ToF Tandem MS getestet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Tetramere von SARS eine andere Anordnung von Untereinheiten haben als die Tetramere von PEDV und 229e. Weiterhin dissoziierten die Komplexe von FIP und TGEV bemerkenswert ähnlich. Diese Resultate erlaubten die Validierung eines prognostizierten strukturellen Modells des TGEV Trimers.
In einer dritten Reihe von Experimenten benutzte ich Matrix-assistierte Laser-Desorption-Ionisierung (MALDI)-MS, um diese Prozesse aus einem anderen Blickwinkel zu betrachten. Die in vitro Prozessierung von hCoV-229e NSP7-10 wurde auch hier untersucht. MALDI-MS wurde auch mit chemisch vernetzten FIP und 229e-CoV Komplexen durchgeführt. Die gefundenen Prozessierung- und Interaktionsmuster stimmten mit den Ergebnissen der nativen MS überein.
In einem vierten und letzten Experiment untersuchte ich gespaltenes und ungespaltenes TGEV-CoV NSP7-8 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch (HDX)-MS. Klare Unterschiede in der Deuterium Aufnahme in spezifischen Regionen wiesen auf enorme Umstrukturierungen durch die Prozessierung hin. Die Visualisierung dieser Ergebnisse auf strukturellen Proteinmodellen förderte das Verständnis der Komplex-Bindestellen und erklärte die Instabilität der NSP8 Untereinheit, wenn sie vom Komplex isoliert vorliegt.
Zusammengefasst, unterschiedliche molekulare Prozesse der Prozessierung von CoV-NSP7-10 wurden mit Methoden der strukturellen Massenspektrometrie untersucht. Die CoV Spezies unterscheiden sich durch Spalteffizienzen in NSP7-10 und Komplexarchitektur von NSP7+8. Diese Ergebnisse erlauben neue Einblicke in Protein-Protein Interaktionen, welche als essentiell für Coronaviren gelten und könnten daher helfen, um antivirale Wirkstoffe zu entwickeln.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8336
URN: urn:nbn:de:gbv:18-99666
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Uetrecht, Charlotte (Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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