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Titel: Einfluss verschiedener Kulturbedingungen auf die Maturierung Stammzell-abgeleiteter humaner Herzmuskelgewebe
Sonstige Titel: Influence of different culture conditions on maturation of stem cell-derived human heart muscle tissue
Sprache: Deutsch
Autor*in: Hörmann, Larissa
Schlagwörter: Stammzell-abgeleitete humane Herzmuskelgewebe; Kulturbedingungen; induzierte pluripotente Stammzellen; Maturierung; human stem cell-derived cardiac muscle tissue; culture conditions; induced pluripotent stem cells; maturation
GND-Schlagwörter: Herzmuskel; Reife
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-05-28
Zusammenfassung: 
Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen eine der häufigsten Todesursachen europa- und weltweit dar. Mit derzeitig angewandten Therapieoptionen werden lediglich Symptome verbessert und das weitere Fortschreiten der Krankheit verlangsamt. Individualisierte kausale Therapieansätze fehlen bislang. Kardiomyozyten abgeleitet aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC-Kardiomyozyten) könnten neue therapeutische und diagnostische Optionen bei kardiovaskulären Erkrankungen bieten, aber der momentane unreife, eher fetale Zustand und die undefinierten serumbasierten Kulturprotokolle schränken ihr Potenzial ein. Die Kultur von hiPSC-Kardiomyozyten als dreidimensional konstruiertes Herzgewebe (Engineered Heart Tissue, EHT) fördert die physiologische, strukturelle und metabolische Reife.

In dieser Arbeit wurde das Standard-EHT-Medium auf Pferdeserumbasis mit einem serumfreien Maturierungsmedium (Mercola Labor, Stanford, Vereinigte Staaten, unveröffentlichtes Protokoll) verglichen, welches in 2D-Kulturen zu beeindruckenden Ergebnissen führte. In drei aufeinander folgenden Versuchsdurchläufen mit zwei verschiedenen weiblichen gesunden Kontrollzelllinien wurde analysiert, ob zusätzliche Maturierungseffekte bei hiPSC-Kardiomyozyten in EHT-Kultur erzielt werden können. Nach einer Formationsphase in serumhaltigem Standard-EHT-Medium wurde die Hälfte der EHTs für 30 - 50 Tage in dem Maturierungsmedium kultiviert oder im Standardmedium belassen. Die videooptischen Analysen der Kontraktionen zeigten eine ähnliche Kraftentwicklung über die Kulturzeit sowie eine positive Kraft-Frequenz-Beziehung und β-adrenerge Reaktion in beiden Gruppen. Als Hinweis auf die funktionelle Reifung blieben die EHTs im Maturierungsmedium formstabiler und hörten nach 50 Tagen nahezu auf spontan zu schlagen, reagierten jedoch weiterhin positiv auf elektrische Stimulation. Des Weiteren wiesen sie einen vermehrt oxidativen Metabolismus und eine bessere histologische Struktur bei Immunfärbungen von MLC2v und α-Actinin, sowie in elektronmikroskopischen Aufnahmen auf.

Die Ergebnisse legen nahe, dass das neue serumfreie Maturierungsmedium die Reife und Stabilität von EHTs weiter erhöhen und dazu beitragen kann, das volle Potenzial von hiPSC-Kardiomyozyten auszuschöpfen. Die für die Generierung von EHTs notwendigen Herstellungs- und Kulturschritte in serumhaltigem Medium und die begrenzte Anzahl der Versuchsdurchläufe limitieren die Aussagekraft dieser Arbeit. In zukünftigen Analysen und Projekten muss ein Kulturprotokoll herausgearbeitet werden, welches den Anforderungen der guten Herstellungspraxis (good manufacturing practice, GMP) komplett gerecht wird und das volle Potenzial von hiPSC-Kardiomyozyten für humantherapeutische Möglichkeiten nutzbar macht. Je definierter und bekannter die Herstellungsschritte und die Kultur von EHTs werden, desto sicherer kann das Produkt eingestuft und für therapeutische Zwecke eingesetzt werden.

Cardiovascular diseases are one of the most common causes of death in Europe and around the world. The currently available treatment options improve symptoms but only slow the progression of the disease. Individualized causal therapeutic approaches are so far missing. Cardiomyocytes derived from humane induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) could offer new therapeutic and diagnostic options for heart diseases, but the current immature and rather fetal state and undefined serum-based culture protocols limit their potential. The culture of hiPSC-CM as Engineered Heart Tissues (EHT) promotes physiological, structural, and metabolic maturity.

In this thesis the standard horse serum-based EHT medium was compared with a serum-free maturation medium (Mercola Lab, Stanford, United States of America, unpublished protocol), which produced impressive results in previous 2D cultures. EHTs from three independent differentiation runs with two different female healthy control cell lines were compared whether a serum-free culture in maturation medium further increases maturation of hiPSC-CM. After a formation phase in serum-containing standard EHT medium, half of the EHTs were transferred to the maturation medium for 30 - 50 days or left in the standard medium. The video-optical analysis of the contractions showed a similar force development over culture time, a positive force-frequency relationship and β-adrenergic reaction in both groups. As an indication of functional maturation, EHTs in the maturation medium remained more stable and almost stopped beating spontaneously after 50 days, but remained responsive to electrical stimulation. Furthermore, they showed a better oxidative metabolism and a better histological structure in immunostaining of MLC2v and α-actinin and in electron microscopy.

The results suggest that the new serum-free maturation medium further increases the maturation and stability of EHTs and help to unravel the full potential of hiPSC-CM. The serum-containing production and culture steps in the beginning of the EHT generation and the limited number of experimental runs limit the generalizability of the results. In future analyzes and projects, a culture protocol that adheres to good manufacturing practice (GMP) should be developed, which makes the full potential of hiPSC-CM available for human therapeutic possibilities. The more defined and better known the manufacturing steps and the culture of EHTs become, the safer the product can be classified and used for therapeutic purposes.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8401
URN: urn:nbn:de:gbv:18-104847
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Eschenhagen, Thomas (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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