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Titel: Analyse von Struktur und Dynamik ausgewählter Enzyme und potenzieller Wirkstofftargets unter Anwendung gepulster Synchrotron- und X-FEL Strahlung
Sonstige Titel: Analysis of the structure and dynamics of selected enzymes and potentiell drug targets applying Synchrotron- and X-FEL radiation
Sprache: Deutsch
Autor*in: Werner, Nadine
GND-Schlagwörter: Biochemie; Strukturbiologie; Molekularbiologie; Röntgenstrukturanalyse; Strukturaufklärung; Kristallstrukturanalyse
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-02-28
Zusammenfassung: 
Bakterielle Infektionen sind die Ursache einer Vielzahl von Krankheiten. Seit den 1930er Jahren werden Antibiotika zur Behandlung eingesetzt, allerdings haben sich verschiedene Mechanismen von Resistenzen gebildet. Diese Arbeit gliedert sich in zwei Bereiche, die im Zusammenhang mit der Problematik bakterieller Infektionen stehen. Die Funktion von zwei Enzymen wird anhand moderner strukturbiologischer Methoden charakterisiert. Im ersten Teil wird ein Protein behandelt, das β-Lactam Antibiotika hydrolysiert. Der zweite Teil der Arbeit charakterisiert ein Enzym, dessen Funktion auf der Störung des Quorum Sensing beruht. Diese Kommunikation zwischen Bakterien, spielt bei der Bildung von Biofilmen eine regulatorische Rolle. Innerhalb dieser Biofilme sind die Bakterien vor äußeren Einflüssen wie Antibiotika geschützt und die Erkrankungen somit nur schwer behandelbar.
Antibiotika-resistente Bakterien führen weltweit zu tausenden Todesfällen. Dabei treten auch vermehrt multiresistente Erreger auf, gegen die die meisten heute bekannten Antibiotika wirkungslos sind. Die β-Lactamase CTX-M-14 hydrolysiert den Lactamring von β-Lactam Antibiotika. Diese gehören zu den bis heute am häufigsten verabreichten Antibiotikaklassen. Eine Inhibierung dieser β-Lactamasen ist daher eine vielversprechende Vorgehensweise, um trotz Resistenzen Infektionen behandeln zu können.
Dazu wurde in dieser Arbeit die strukturelle Untersuchung der β-Lactamase CTX-M-14 aus dem pathogenen Bakterium Klebsiella Pneumoniae in Kooperation mit den Arbeitsgruppen von Prof. M. Aepfelbacher und Prof. H. Rohde (UKE) durchgeführt. Dieses medizinisch bedeutsame, da weit verbreitete Enzym wurde für verschiedene Röntgendiffraktions-messungen kristallisiert. Zu diesem Zweck wurde das Protein rekombinant exprimiert und gereinigt. Es wurden Kristallisationsprotokolle entwickelt und optimiert, um reproduzierbare Kristalle definierter Größen zu erhalten und Diffraktionsdaten an verschiedenen Synchrotron- und XFEL-Strahlungsquellen aufgenommen. Die Proteinkristalle wurden vor der Messung mit neu zugelassenen β-Lactamaseinhibitoren versetzt, um ein besseres Verständnis von deren Bindung an das Enzym zu ermöglichen. Durch die reproduzierbare Kristallisation von Mikrokristallen können auch zukünftig verschiedene Wirkstoffe untersucht werden, um in einem zeitlich vertretbaren Rahmen Inhibitoren für β-Lactamasen zu entwickeln.
Viele Bakterien bilden Biofilme, die sie vor äußeren Einflüssen wie Antibiotika schützen. Biofilme spielen aber nicht nur in der Medizin eine große Rolle, sondern treten ubiquitär in der Umwelt auf. Die Bildung der Biofilme wird mittels Quorum Sensing, einem chemischen Kommunikationssystem, von den Bakterien in Bezug auf ihre Zelldichte abgestimmt. Der Mechanismus des Quorum Quenching verhindert diese Art der Kommunikation, wodurch die Bildung von Biofilmen verhindert werden kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde, die zu den Quorum Quenching Enzymen gehörende Acylase GqqA in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. W. Streit (Biozentrum, UHH) untersucht. Diese stammt aus dem Biofilm-produzierendem Essigsäurebakterium Komagataeibacter europaeus, welcher eine Bedeutung in der traditionellen Essigsäureproduktion hat. Bisher gab es keine Daten zur strukturellen Charakterisierung dieses Proteins. GqqA wurde rekombinant hergestellt und die Reinigung optimiert. Das Protein wurde in Lösung mit Messungen der dynamischen Lichtstreuung und des Circulardichroismus untersucht und erste strukturelle Informationen mit SAXS-Messungen gesammelt. GqqA wurde kristallisiert und die Kristalle mittels Seeding optimiert, um Röntgendiffraktionsdaten aufzunehmen. Aufgrund der geringen Homologie zu anderen Proteinen war eine Lösung des Phasenproblems mittels Molekularem Ersatz nicht möglich. Aus diesem Grund wurde das Protein in Minimalmedium mit Selenomethionin exprimiert. Mithilfe der eingebauten Selenatome konnte die Struktur durch SAD gelöst werden. Überraschenderweise enthielt die Struktur des SeGqqA nur zwei der erwarteten drei Domänen. Die vollständige Proteinstruktur konnte schließlich mit der SeGqqA-Struktur durch Molekularen Ersatz gelöst werden. Strukturell ähnelt GqqA den Prephenatdehydratasen, besitzt aber eine Acylase-Aktivität. Die Struktur unterscheidet sich von allen bisher bekannten Quorum Quenching Enzymen. Um die Oligomerisierung des Enzyms zu untersuchen wurden nach Analyse der Quartärstruktur und der Kristallkontakte fünf Mutanten erstellt und mit deren Charakterisierung begonnen.

Bacteria are the major source of infectious diseases. Since the 1930s antibiotics have been used to treat infections but different mechanisms of antibiotic resistance evolved. This thesis focuses on two proteins. One of them is a β-lactamase, which can hydrolyze β-lactam antibiotics. The other protein interrupts cellular communication called quorum sensing between bacteria, which plays a crucial role in biofilm formation. Inside these biofilms the bacteria are protected from outer influences like antibiotics and cannot efficiently be treated.
Antibiotic resistant bacteria cause thousands of deaths worldwide. There is also an increasing number of bacteria, which are multi-resistant and very difficult to medicate. β-Lactamases are enzymes which cleave the lactam ring of β-lactam antibiotics. These β-lactam antibiotics belong till now to the most frequently used classes of antibiotics. To combat bacterial infections the application of β-lactamase inhibitors is a common treatment in combination with β-lactam antibiotics who target the cell wall biosynthesis.
In the course of this work research on the β-lactamase CTX-M-14 from the pathogenic bacteria Klebsiella Pneumoniae was performed in cooperation with the groups of Prof. M. Aepfelbacher und Prof. H. Rohde (UKE). This enzyme is spread worldwide and plays an important role in resistance against β-lactam antibiotics. Crystallization of CTX-M-14 was established for different methods of X-ray diffraction data collection. Therefore, the protein was recombinantly expressed and purified. Crystals of various sizes were produced and measured at different synchrotron and XFEL radiation sources. The crystals were soaked with newly established β-lactamase inhibitors to elucidate their binding mechanisms to the enzyme. Established reproducible production of microcrystals allows a screening of different compounds to support future drug discovery approaches.
Many bacteria produce biofilms to prevent themselves from outer influences like antibiotics. Biofilms are not only a problem in medicine but are ubiquitous in the environment. The formation of biofilms is population density controlled via chemical communication by various small molecules called autoinducers. This communication is well known as quorum sensing. It can be interrupted by enzymatic quenching of this signal to prevent or stall biofilm formation. These mechanisms are called quorum quenching.
In the course of this work the acylase GqqA, which belong to the quorum quenching enzymes, was investigated in cooperation with the group of Prof W. Streit (Biozentrum, UHH). The enzyme is produced by the biofilm forming bacteria Komagataeibacter europaeus, which plays a role in the traditional vinegar production. Until now, there is no information available about the structural characterization of this protein. GqqA was recombinantly produced and the purification protocol was optimized. First structural information was obtained with DLS and CD spectroscopy, followed by SAXS measurements of the protein in solution. The protein crystallization was optimized with seeding experiments and first diffraction data were collected. Due to a low sequence homology to other proteins, it was not possible to solve the phase problem with molecular replacement. To overcome this problem the protein was expressed in minimal media supplemented with selenomethionine. The crystal structure of this protein was solved with SAD. Surprisingly, one of the expected three domains was missing in SeGqqA. This structure allowed to solve the complete structure by molecular replacement of crystals of the complete GqqA. Even the overall structure of GqqA is similar to known prephenate dehydratases, it has acylase activity, but a different polypeptide-fold compared to any till now known quorum quenching enzymes. Five mutants of GqqA were produced and their functional and structural characterization was initiated.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8421
URN: urn:nbn:de:gbv:18-105232
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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