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Titel: The putative role of HERC5 in NSCLC metastasis and its potential utility as a liquid biopsy marker
Sonstige Titel: Die mutmaßliche Rolle von HERC5 in der NSCLC Metastasierung und sein potentieller Nutzen als Flüssigbiopsie-Marker
Sprache: Englisch
Autor*in: Schneegans, Svenja
Schlagwörter: Extrazelluläre Vesikel; Liquid biopsy
GND-Schlagwörter: Lungenkrebs; Onkologie; Proteine
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-06-26
Zusammenfassung: 
Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for the majority of lung cancer cases, with the overall five-year survival rate being only around 15%.
Metastasis remains the primary cause for all cancer-related deaths, including NSCLC.
Metastatic relapse is caused by disseminated tumor cells (DTCs), which have been able to escape the primary tumor and outgrow at distant organs.
Recently, HERC5 has been identified as a potential metastasis suppressor gene in NSCLC, as its loss was correlated with positive DTC status as well as occurrence of brain metastasis and shortened both disease-free and overall survival.
This thesis investigated the role of the putative metastasis suppressor HERC5 in early dissemination.
In lung cancer cell lines, low HERC5 expression was significantly associated with an elevated aggressive phenotype including increased migratory potential, as well as clonogenic and anchorage-independent growth, while proliferative capacity was not altered. These characteristics indicate that HERC5 harbors metastasis-suppressing function rather than onco-suppressing properties.
Since HERC5 has been associated with increased metastasis formation in brain and bone, the microenvironmental influence of these tissues was analzyed as well, but were shown to have no effects on the HERC5-mediated carcinogenic traits in the model systems.

Interestingly, RNAseq analysis of HERC5 overexpressing and control cell lines did not show alterations in downstream pathways, as only two genes were found to be differentially regulated. This indicates that the oncogenic function of HERC5 might be regulated more at the protein level via its E3 ligase activity.

Previous studies linked HERC5 function mainly to viral defense mechanisms and regulation of the innate immune response. In endothelial cells HERC5 is upregulated by inflammatory cytokines such as TNFa or interferons, hereby catalyzing the transfer of the ubiquitin-like modifier ISG15 onto target proteins as an E3 ligase.
The ISGylation of target proteins induces pleiotropic effects such as DNA repair, interference with the ubiquitin system and exosome secretion.
The present study aimed at identifying novel interacting and ISG15 target proteins in NSCLC cell lines after activation by inflammatory cytokines.
SILAC-based proteomic analysis revealed 42 HERC5 ISGylation targets. However, no specific pathway was found to be altered when performing gene annotation enrichment analysis, possibly indicating
a lower impact of IFNg and TNFa in protein ISGylation on immune-related processes in NSCLC.

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cell-cell-communication. Tumor-derived EVs have been previously shown to prime the so-called pre-metastatic niche by inducing e.g. vascular leakage, remodeling of the extracellular matrix, and immunosuppression.
The here presented study demonstrated that under inflammatory conditions, the secretion of EVs is enhanced in HERC5-depleted lung cancer cells. Moreover, preliminary results indicated that EV protein cargo is specifically altered in these cells.
In contrast to the limited amount of intracellular pathways affected by ISGylation, functional annotation analysis of EV proteins revealed an enrichment of pathways connected to innate immune responses as well as cell adhesion showing a possible link between HERC5 expression and an immunomodulatory function of the vesicles.


Early detection of cancer is highly important for prevention of primary and metastatic disease.
Liquid biopsies from blood of cancer patients can give important information on the tumor state and evolution without the necessity of invasive procedures.
Moreover, the combined analysis of different liquid biomarkers can give complimentary information on disease state compared to single analysis.
A prerequisite for clinical utility is also the development of standard operating procedure (SOPs) for these highly sensitive assays.
Here, we show the feasibility of a combined liquid biopsy assay, obtaining results from circulating tumor cells (CTCs), circulating tumor DNA (ctDNA), and miRNAs from a single blood draw. The outcome of the analysis, however, strongly depends on the selection of blood-collection tube and normalization methods of next-generation sequencing data, indicating the importance of strict SOPs. Furthermore, a method for standardized, semi-automated detection of CTCs from cancer patients was established.
Combined, these results are important prerequisites for the establishment of a HERC5-based liquid biopsy assay in the future.

Taken together, the results indicate that low HERC5 levels elevate metastatic potential in vitro. Its impact on extracellular signaling via EVs in an immunomodulatory context is increased while intracellular pathways are less affected by HERC5 levels and ISGylation of proteins.
Further analysis needs to be performed to evaluate the exact nature of tumor and immune cell cross talk. Liquid biopsy experiments could validate whether HERC5 could become a blood-based biomarker aiding in early detection of relapse in NSCLC.

Das Nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (NSCLC) stellt die Mehrheit aller Lungenkrebs-fälle dar, dessen Fünf-Jahres-Überlebensrate bei lediglich circa 15% liegt.
Metastasen bilden den Hauptgrund für alle krebsbedingten Todesfälle, einschließlich NSCLC.
Rückfalle der Metastasierung werden durch disseminierte Tumorzellen (DTCs) verursacht, die es geschafft haben, dem Primärtumor zu entweichen und in entfernten Organen herauszuwachsen.
Aktuelle Studien identifizierten HERC5 als potentielles Metastase-Suppressorgen, denn es korreliert sowohl mit positivem DTC-Status als auch Gehirnmetastasierung und einem verkürzten krankheitsfreien- und Gesamtüberleben in Lungenkrebspatienten.

Die vorliegende Studie untersucht die Rolle des potentiellen Metastasesuppressors HERC5 im Zusammenhang mit früher Disseminierung. In Lungenkrebs-Zelllinien wurde HERC5 mit einem erhöhten aggressiven Phänotyp assoziiert, welcher ein erhöhtes Migrationspotential, klonogenes Überleben und Wachstumsfähigkeit in Suspension beinhaltet. Unverändert bleibt dabei die proliferative Kapazität. Diese Charakteristika deuten darauf hin, dass HERC5 eher Metastase-supprimierende als onkogene Funktionen besitzt.
Aufgrund der erhöhten Metastasierungsrate in Gehirn und Knochen durch geringe HERC5 Expression wurde der Einfluss dieser Mikroumgebungen ebenfalls analysiert. Es wurden keine Effekte auf HERC5 vermittelte, karzinogene Eigenschaften in den Modellsystemen festgestellt.

Bemerkenswert ist, dass durch RNA-Sequenzierung von HERC5-überexprimierenden und Kontrollzelllinien keine Veränderungen in nachgeschalteten Signalwegen nachgewiesen wurden, denn nur zwei differentiell reguliert Gene wurden identifiziert. Daher könnte die onkogene Funktion von HERC5 viel mehr auf Proteinebene anhand seiner E3 Ligaseaktivität reguliert sein.

Vorherige Studien brachten die Funktion von HERC5 hauptsächlich mit viralen Abwehrmechanismen und Regulation der angeborenen Immunantwort in Verbindung. In Endothelzellen wird HERC5 durch inflammatorische Zytokine wie TNFa oder Interferone hochreguliert, wodurch der Transfer der Ubiquitin-ähnlichen Modifikation ISG15 auf Zielproteine katalysiert wird. Die ISGylierung von Zielproteinen bewirkt pleiotropische Effekte, wie unter anderem DNA-Reparatur, Beeinträchtigung des Ubiquitin-Systems und Freisetzung von Exosomen.
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, nach Aktivierung durch inflammatorische Zytokine neue Interaktionspartner und ISG15 Zielproteine in NSCLC zu identifizieren. SILAC-basierte Proteomanalysen ergaben 42 von HERC5 ISGylierte Zielproteine. Jedoch wurde kein spezifischer Signalweg beeinflusst,
was auf einen geringeren Einfluss von IFNg und TNFa auf Protein ISGylierung in Immun-bezogenen Prozessen in NSCLC hindeutet.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind essentielle Mediatoren der Zell-Zell-Kommunikation. Von Tumoren freigesetzte EVs wurden beschrieben, die sogenannte prä-metastatische Nische zu etablieren, beispielsweise durch Induktion von Gefäßdurchlässigkeit, Remodulierung der extrazellulären Matrix und Immunsuppression.
Die gegenwärtige Studie demonstrierte eine verstärkte Sekretion von EVs in HERC5-dezimierten Lungenkrebs-zellen unter inflammatorischen Bedingungen. Darüber hinaus deuten vorläufige Ergebnisse darauf hin, dass der Inhalt von EVs spezifisch in diesen Zellen verändert ist.
Im Gegensatz zum geringen Einfluss durch ISGylierung auf Signalwege in der Zelle,
zeigten Analysen von funktionalen Annotationen in EVs eine Anreicherung von Signalwegen, die sich sowohl mit der angeborenen Immunantwort als auch Zelladhäsion verknüpfen lassen. Dies weist auf eine immunmodulatorische Funktion der Vesikel hin.

Früherkennung von Krebs ist entscheidend zur Prävention von Primärtumoren sowie Metastasen. Flüssigbiopsien aus Blut von Krebspatienten können nicht nur relevante Informationen über den Zustand des Tumors, sondern auch dessen Evolution beinhalten, ohne die Notwendigkeit von invasiven Eingriffen.
Im Vergleich zu Einzelanalysen kann die Kombination von verschiedenen Biomarkern zusätzlich ergänzende Informationen geben.
Die Voraussetzung zur klinischen Nutzung dieser hoch sensitiven Analysen ist ferner die Entwicklung von Standardvorgehensweisen.
Hier zeigt die vorliegende Forschung die Durchführbarkeit einer kombinierten Analyse von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs), zirkulierender Tumor DNA (ctDNA) und miRNA aus einer einzigen Blutabnahme auf. Das Ergebnis dieses Tests hängt allerdings stark ab von der Wahl des verwendeten Blutentnahmeröhrchens und der Normalisierungsmethode von DNA Sequenzierungsdaten, was die Notwendigkeit von normierten Verfahren unterstreicht. Weiterhin wurde eine Methode zur standardisierten, halb-automatischen Detektion von CTCs aus Krebspatienten etabliert.
Beide Ergebnisse schaffen gemeinsam die Voraussetzung zur zukünftigen Entwicklung eines auf HERC5 basierenden Flüssigbiopsie-Tests.

Zusammengefasst deuten die Ergebnisse darauf hin, dass anhand geringer HERC5 Expression das metastatische Potential verstärkt wird. Sein Einfluss auf extrazelluläre Signalwege durch EVs in einem immunmodulatorischen Kontext ist erhöht, während intrazelluläre Signalwege weniger durch HERC5 Level und ISGylierung von Proteinen beeinflusst werden.
Weitere Analysen müssen durchgeführt werden, um die genauen Eigenschaften der gegenseitigen Wechselwirkung von Tumor und Immunzellen zu beurteilen. Zumal könnte mithilfe von Flüssigbiopsie-Studien überprüft werden, ob HERC5 zukünftig als Blut-basierter Biomarker zur Früherkennung von NSCLC-Rückfall fungieren kann.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8445
URN: urn:nbn:de:gbv:18-105564
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Dobler, Susanne (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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