Mutation analysis of the DICER1 gene in Pleuropulmonary Blastoma

Abstract

The pleuropulmonary blastoma is a very rare malignancy of childhood, but is still the most common pediatric lung tumor. It is an aggressive neoplasm and part of the newly discovered DICER1-Syndrome. This syndrome is characterized by mutations in the DICER1 gene and a wide variety of clinical phenotypes. In this thesis, molecular genetic examinations of the so far largest German patient collective were performed. The methods used, included PCR, Sanger sequencing, multiplex ligation-dependent probe amplification and OncoScan® (the latter not part of this thesis).

In six patients, a total number of nine mutations and a large deletion spanning the entire DICER1 gene locus were detected. Of the nine mutations, four had not been described in the literature. It was determined, that splice site mutation c.1510-1G>A of patient 18 and the large DICER1 gene deletion of patient 12 were de novo germline mutations, predisposing these individuals to the DICER1-Syndrome. The deletion was detected by MLPA and could be specified to a size of 582kb by OncoScan®. Such a deletion has only been published once in a patient with PPB before. Five mutations were located on the RNase IIIb domain of DICER1. This domain contains hotspot regions for DICER1-Syndrome mutations. The distribution of the nine mutations, is in line with the so-called modified two-hit-hypothesis. Here, usually a germline DICER1 mutation predisposes to a greater risk of disease, which is later induced by somatic mutations. There is a retained function of DICER1, when there are hotspot DICER1 mutations in PPB. The mutations affect the processing of miRNA strands by DICER1 and are part of RNA interference (RNAi). A new equilibrium of the miRNA strands is thought to be a cancerogenous trigger of PPB. The exact mechanisms are not understood so far.

Upon diagnosis of PPB, subsequent PCR and Sanger studies should be performed to look for DICER1 mutations. In germline negative cases, a screening for mosaicism and biallelic somatic mutations should follow. Analysis for copy-number-variations by MLPA can be added, when no germline mutation was found. However, the routine use of MLPA is hindered, since currently no commercial DICER1-kit is available and the use of synthetic oligonucleotides is required. A thorough patient and extended family history, with a focus of known DICER1-Syndrome phenotypes should be taken. Because of the autosomal-dominant pattern, the risk of inheritance to later generations is increased. Depending on the type of mutation, the risk of further disease is also increased. These aspects should be addressed in a genetic counseling of the patient and family. An enrollment in the International PPB Registry is strongly recommend, when a DICER1-Syndrome is suspected or confirmed, to help advancing disease-specific research and to be able to profit from latest studies regarding screening and therapy.

Das Pleuropulmoblastom (PPB) ist ein insgesamt sehr seltener, aber dennoch der häufigste pädiatrische Lungentumor. Dieser aggressive Tumor ist eine mögliche Ausprägungsform des kürzlich beschriebenen DICER1-Syndroms, welches noch eine Vielzahl anderer Phänotypen hervorrufen kann. In dieser Arbeit wurde das bisher größte deutsche PPB-Patientenkollektiv molekulargenetisch mittels PCR, Sanger Sequenzierung, Multiplex ligation-dependent probe amplification sowie OncoScan® (letzteres war nicht Teil dieser Arbeit) untersucht.

Insgesamt wurden bei sechs Patienten neun Mutationen sowie eine große Deletion, die den Genlokus des DICER1 Gens umfasst, identifiziert. Vier der neun Mutationen wurden bisher nicht in der Literatur beschrieben. Die Deletion wurde mittels MLPA detektiert und zeigte im OncoScan® eine Größe von 582kb. Eine DICER1 umfassende Deletion wurde bisher erst bei einem weiteren PPB-Patienten beschrieben. Sowohl die Splicevariante c.1510-1G>A von Patient 18 als auch die Deletion von Patient 12 stellen de novo Keimbahnmutationen dar, welche diese Patienten zum DICER1-Syndrom prädisponieren. Fünf Mutationen waren in der RNase IIIb Domäne von DICER1 lokalisiert. In dieser Domäne finden sich hotspot regions für DICER1-Syndrom Mutationen. Die in dieser Arbeit gefundenen neun Mutationen passen zum Verteilungsmuster der sogenannten modifizierten 2-Treffer-Hypothese. Dabei haben die Betroffenen eine Keimbahnmutation sowie eine im Verlauf erworbene somatische Mutation, die oft die RNase IIIb Domäne betrifft, und zu keinem vollständigen Funktionsverlust von DICER1 führt. Die Mutationen beeinflussen die miRNA-Biosynthese, die Teil der RNA-Interferenz (RNAi) ist. Möglicherweise entsteht ein neues Gleichgewicht verschiedener miRNA-Stränge, die letztlich für die Entstehung des PPB mitverantwortlich sind. Hierbei sind jedoch noch nicht alle Aspekte abschließend erforscht.

Im Falle einer PPB-Diagnose sollten weitere molekulargenetische Untersuchungen mit PCR und Sanger Sequenzierungen in Hinblick auf DICER1-Mutationen erfolgen. Falls sich keine Keimbahnmutation findet, sollten Untersuchungen auf Mosaike und biallelische somatische Variationen angeschlossen werden. Mittels MLPA können Deletionen sowie Duplikationen festgestellt werden. Allerdings gibt es kein kommerziell erwerbbares DICER1-kit, so dass synthetische Oligonukleotide verwendet werden müssen. Ferner sollte eine ausführliche Patienten- und Familienanamnese in Hinblick auf bekannte DICER1-Syndrom-Phänotypen erfolgen. Aufgrund des autosomal-dominanten Vererbungsmusters ist das Risiko für Folgegenerationen erhöht, allerdings ist die Penetranz reduziert. Je nach genetischer Konstellation besteht ein Risiko für weitere Erkrankungen aus dem DICER1-Spektrum. Diese Aspekte sollten den Betroffenen im Rahmen einer genetischen Beratung erläutert werden. Alle Patienten mit einem vermuteten oder gesicherten DICER1-Syndrom, sollten beim International PPB Registry angebunden werden. Die dort gesammelten Daten sind sowohl elementar für die weitere Erforschung dieses seltenen Syndroms, als auch für die dazugehörige Diagnostik und Therapie.