Identifizierung neuer antiplasmodialer Wirkstoffe und Validierung von PfGSK3 als potentiellen Medikamentenangriffspunkt gegen Malaria

Abstract

Mit über 228 Mio. Infektionen im Jahr 2018, von denen ca. 405 000 tödlich verliefen, ist Malaria eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten der Welt. Verursacht wird die Erkrankung durch Protozoen der Gattung Plasmodium, deren asexuelle Vermehrung in den roten Blutzellen für sämtliche klinischen Symptome der Malaria verantwortlich ist. Durch die globale Verbreitung von Multi-Drug-resistenten Parasiten und die Abwesenheit eines effektiven Impfstoffes stellt Malaria nach wie vor eine ernste Bedrohung der globalen Gesundheit dar, weshalb dringend neue antiplasmodiale Wirkstoffe benötigt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Validierung neuer antiplasmodialer Verbindungen sowie die Charakterisierung der plasmodialen Glykogen Synthase Kinase 3 (PfGSK3) als potentielles antiplasmodiales Drug Target, wobei diese Kinase eine wichtige Rolle bei der Regulation der Erythrozyteninvasion spielt. Die Invasion von Erythrozyten stellt einen essentiellen Schritt während des parasitären Replikationszyklus dar und wird durch ein Zusammenspiel von hunderten Proteinen vermittelt. Hierbei spielen vor allem Oberflächenproteine eine wichtige Rolle, die durch eine Rezeptor-Liganden-Interaktion eine Bindung an die Wirtszelle ermöglichen. Somit stellt die Wirtszellinvasion einen geeigneten Interventionspunkt für die experimentelle Medikamentenentwicklung dar. Da der Parasit während der Invasion von Erythrozyten für eine kurze Zeit zugänglich für Antikörper des humanen Immunsystems ist, weisen viele der Invasions-beteiligten Proteine einen ausgeprägten Sequenzpolymorphismus auf, der dem Parasiten in der menschlichen Population das Überleben sichert. Eine Möglichkeit, diesen Immunevasionsmechanismus des Parasiten experimentell zu umgehen, stellt sich dar, wenn nicht die Rezeptor-Liganden Interaktion als konzeptioneller Angriffspunkt definiert wird, sondern die ihr zugrunde liegenden Regulationsmechanismen wie zum Beispiel die Phosphorylierung und Dephosphorylierung. Ein Beispiel hierfür ist der essentielle Invasionsligand AMA-1 (Apikales Membran Antigen 1), der mithilfe einer Phosphorylierungskaskade in seiner Aktivität reguliert wird. Hierbei sind mindestens zwei Kinasen beteiligt, namentlich Protein Kinase A und die Glykogen Synthase Kinase 3. Somit stellen auch Kinasen vielversprechende Drug Targets für neue antiplasmodiale Verbindungen dar. In der vorliegenden Arbeit konnten neue Thieno[2,3-b]pyridin-Verbindungen als PfGSK3-spezifische Inhibitoren identifiziert werden, die eine IC50 zwischen 0,26 und 4,53 µM gegen rekombinante PfGSK3 und 0,6 und 9,4 µM gegen P. falciparum Parasiten aufweisen. Diese spezifischen Inhibitoren wurden in Kombination mit Reverse Genetics Strategien genutzt, um PfGSK3 genauer als antiplasmodiales Target zu validieren. Sowohl die Inhibitoren-basierten Ergebnisse als auch die genetischen Experimente unterstreichen die wichtige Rolle von PfGSK3 bei der Invasion von Erythrozyten durch den Parasiten. Als Weiterentwicklung der PfGSK3-inhibierenden Thieno[2,3-b]pyridin-Verbindungen wurden zudem Thieno[2,3-b]pyridine-2-carboxamide als potentielle antiplasmodiale Verbindungen validiert. Die untersuchten Verbindungen zeichnen sich durch eine antiplasmodiale Aktivität im nanomolaren Konzentrationsbereich und eine über 100-fache Selektivität gegenüber humanen Zellen aus. Der Wirkmechanismus wird hierbei jedoch trotz strukturell starker Ähnlichkeit zu den Thieno[2,3-b]pyridin-Verbindungen nicht durch eine Hemmung der PfGSK3 vermittelt. Zusätzlich wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuer Naturstoff, PDE-I2 aus Streptomyces sp. als neuer antiplasmodialer Wirkstoff validiert. Dieser wurde mithilfe eines phänotypischen Screens der Wright Actinomycete Collection (WAC) identifiziert und durch mehrstufige Fraktionierungsansätze rein dargestellt. PDE-I2 stellt das Produkt einer unvollständigen Duocarmycin-Synthese in Streptomyces sp. dar. PDE-I2 zeichnet sich durch eine antiplasmodiale Aktivität im unteren nanomolaren Bereich (IC50: 30,9 nM) und eine 1100-fache Selektivität gegenüber humanen Zellen aus. Die Aktivität von PDE-I2 wird wie bei verwandten Verbindungen der Duocarmycin-Familie vermutlich durch Interaktion mit AT-reichen Regionen der genomischen DNA vermittelt.

With over 228 million infections in 2018, of which about 405,000 were fatal, malaria is one of the most important infectious diseases in the world. The disease is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium, whose asexual reproduction within red blood cells is responsible for all clinical symptoms of malaria. Due to the global spread of multi-drug resistant parasites and the lack of an effective vaccine, malaria continues to pose a serious threat to global health, highlighting that new antiplasmodial agents are urgently needed. The aim of the present work was to identify and validate new antiplasmodial compounds as well as to characterize the plasmodial glycogen synthase kinase 3 (PfGSK3) as a potential antiplasmodial drug target. This kinase plays an important role in the regulation of erythrocyte invasion. The invasion of erythrocytes is an essential step during the parasitic replication cycle and is mediated by the interaction of hundreds of proteins. Parasite surface proteins play a particularly important role in this process, enabling binding to the host cell membrane through receptor-ligand interactions. Thus, host cell invasion represents a suitable intervention point for experimental drug development. Since the parasite is accessible to antibodies of the human immune system for a short period of time during the invasion of erythrocytes, many of the invading proteins exhibit a distinct sequence polymorphism that ensures the survival of the parasite in the human population. For drug development, instead of targeting the receptor-ligand interaction itself, one way to experimentally circumvent the immune evasion mechanism of the parasite is to target the underlying regulatory mechanisms such as phosphorylation and dephosphorylation. An example of this is the essential invasion ligand AMA-1 (Apical Membrane Antigen 1), whose activity is regulated by a phosphorylation cascade. At least two kinases are involved, namely protein kinase A and PfGSK3, making kinases promising targets for new antiplasmodial compounds. In the present work new thieno[2,3-b]pyridine compounds were identified as PfGSK3-specific inhibitors. All new compounds had IC50 values between 0.26 and 4.53 µM against recombinant PfGSK3 and 0.6 and 9.4 µM against P. falciparum parasites. These specific inhibitors were used in combination with reverse genetics strategies to further validate PfGSK3 as an antiplasmodial target. Both the inhibitor-based results and the genetic experiments emphasise the important role of PfGSK3 in the invasion of erythrocytes by the parasite. As a further development of the PfGSK3-inhibiting thieno[2,3-b]pyridine compounds, thieno[2,3-b]pyridine-2-carboxamides were also validated as potential antiplasmodial agents. The investigated compounds are characterized by an antiplasmodial activity in the nanomolar concentration range and a more than 100-fold selectivity towards human cells. However, the antiplasmodial effect is not mediated by an inhibition of PfGSK3 despite the strong structural similarity to the thieno[2,3-b]pyridine compounds. In addition, a new natural compound, PDE-I2, from Streptomyces spp. was validated as a new antiplasmodial agent in the present study. This compound was identified using a phenotypic screen of the Wright Actinomycete Collection (WAC) and was purified by multi-step fractionation approaches. PDE-I2 represents the product of an incomplete duocarmycin synthesis in Streptomyces spp. PDE-I2 is characterized by an antiplasmodial activity in the lower nanomolar range (IC50: 30.9 nM) and a 1100-fold selectivity towards human cells. The activity of PDE-I2 is likely mediated by interactions with AT-rich regions of genomic DNA, as it was shown for related compounds of the duocarmycin family.