Characterization of Interactions between the Neural Cell Adhesion Molecule L1 and Nuclear Proteins

Abstract

This work shows that the cell adhesion molecule L1 interacts with the nuclear proteins MeCP2, NonO and SFPQ via its intracellular domain. The interaction between L1 and NonO/SFPQ is shown using ELISA and co-immunoprecipitation, and verified in vitro using proximity ligation assay in cerebellar granule cells. Stimulation of L1-signalling which leads to cleavage and generation of the L1 fragments L1-70 and L1-30 and their internalization and import into the nucleus, increased the number of positive signals in the proximity ligation assay. This indicates for the first time that L1 interacts with NonO and SFPQ in the cellular context, and that this interaction is enhanced via L1-signalling. In addition, immunostainings of NonO and L1 in mouse brain tissue slices showed joint localization of these proteins in regions of the cerebellum and the hippocampus. The interaction between L1 and MeCP2 was confirmed using ELISA, BIND assay and co-immunoprecipitation. In addition, proximity ligation assay experiments using cerebellar granule cells showed close proximity (<40 nm) of L1 and MeCP2. An increase in the signal after stimulation of L1-signalling was observed. Furthermore, the interaction between MeCP2 and in vitro expressed L1 fragments L1-70 and L1-30 was confirmed using co-immunoprecipitation. Stainings in neural stem cells showed co-localization of L1 and MeCP2 in the cytoplasm, which increased with differentiation. Besides, stainings in mouse brain tissue slices from early postnatal mice showed that L1 and MeCP2 co-localize in the nucleus of hippocampal neurons, indicating that L1 and MeCP2 interact in vivo. In order to study the functional consequences of the interaction between L1 and MeCP2 on L1-dependent neural functions, knockdown of MeCP2 was performed in cerebellar granule cells and cortical neurons, and in the mouse cerebellum. Western Blots of cerebellar granule cells and cortical neurons after MeCP2 knockdown showed that both cell types had increased levels of L1-70, possibly due to the effect of MeCP2 on the expression of MBP (protease which cleaves full-length L1 to generate L1-70). Thus, MeCP2 may play a role in regulating L1-mediated cellular functions. Moreover, increased neurite outgrowth was found in wild-type cerebellar granule cells after MeCP2 knockdown, but when studying cerebellar granule cells mutated in the MBP cleavage site after MeCP2 knockdown, neurite outgrowth was not increased. These results indicate that MeCP2 might modulate L1-dependent neurite outgrowth. The novel nuclear L1-binding partners NonO, SFPQ and MeCP2 have important functions in gene regulation, chromatin structure remodelling, DNA repair, RNA processing, cell differentiation, cell growth and maintenance pathways, mitochondrial function, and synaptic transmission. The interaction of L1 with these proteins reveals that proteolytic processing equips L1 with multiple functions, which could play a role in the pathogenesis of many neuronal diseases.

Diese Arbeit zeigt, dass das Zelladhäsionsmolekül L1 über seine intrazelluläre Domäne mit den Kernproteinen MeCP2, NonO und SFPQ interagiert. Die Wechselwirkung zwischen L1 und NonO / SFPQ wurde unter Verwendung von ELISA und Ko-Immunpräzipitation mittels biochemischer Methoden bestäatigt und in vitro in Körnerzellen des Kleinhirns unter Verwendung eines Proximity Ligation Assays gezeigt. Die Stimulierung der L1-Signalübertragung, die zur Spaltung und Erzeugung der L1-Fragmente L1-70 und L1-30 sowie deren Internalisierung und Import in den Kern führt, erhöhte die Anzahl positiver Signale im Proximity Ligation Assay. Dies zeigt erstmals, dass L1 im zellulären Kontext mit NonO und SFPQ interagiert und dass diese Interaktion durch L1-Signaltransduktion verstärkt wird. Zusätzlich zeigten Immunfärbungen von NonO und L1 in Hirngewebeschnitten von Mäusen eine gemeinsame Lokalisierung dieser Proteine in Regionen des Kleinhirns und des Hippocampus. Die Wechselwirkung zwischen L1 und MeCP2 wurde ebenfalls unter Verwendung von ELISA, BIND-Assay und Co-Immunpräzipitation bestätigt. Zusätzlich zeigten Proximity Ligation Assay-Experimente unter Verwendung von Kleinhirn-Körnerzellen eine enge Nähe (<40 nm) von L1 und MeCP2. Ein Anstieg des Signals nach Stimulation des L1-Signaltrasduktion wurde beobachtet. Darüber hinaus wurde die Wechselwirkung zwischen MeCP2 und in vitro exprimierten L1-Fragmenten L1-70 und L1-30 unter Verwendung von Ko-Immunpräzipitation bestätigt. Färbungen in neuralen Stammzellen zeigten eine Ko-Lokalisation von L1 und MeCP2 im Zytoplasma, die mit der Differenzierung zunahm. Außerdem zeigten Färbungen in Maus-Hirngewebeschnitten von frühen postnatalen Mäusen, dass L1 und MeCP2 im Kern von Hippocampus-Neuronen co-lokalisiert sind, was darauf hinweist, dass L1 und MeCP2 in vivo interagieren. Um die funktionellen Konsequenzen der Wechselwirkung zwischen L1 und MeCP2 auf L1-abhängige neuronale Funktionen zu untersuchen, wurde ein MeCP2 Knockdown in Kleinhirnkörnerzellen und kortikalen Neuronen sowie im Kleinhirn von Mäusen realisiert. Western-blots von Kleinhirnkörnerzellen und kortikalen Neuronen nach MeCP2-Knockdown zeigten, dass beide Zelltypen erhöhte L1-70-Werte hatten, möglicherweise aufgrund der Wirkung von MeCP2 auf die Expression von MBP (Protease, die L1 spaltet, um L1-70 zu erzeugen). Somit kann MeCP2 eine Rolle bei der Regulierung von L1-vermittelten Zellfunktionen spielen. Darüber hinaus wurde ein erhöhtes Neuritenwachstum in Wildtyp- Kleinhirnkörnerzellen nach MeCP2-Knockdown gefunden. Im Gegensatz dazu war das Neuritenwachstum von Kleinhirnkörnerzellen, die L1 mit mutierter MBP-Spaltstelle exprimierten nicht erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MeCP2 das L1-abhängige Neuritenwachstum modulieren könnte. Die neuen nukleären L1-Bindungspartner NonO, SFPQ und MeCP2 haben wichtige Funktionen bei der Genregulation, dem Umbau der Chromatinstruktur, der DNA-Reparatur, der RNA-Verarbeitung, der Zelldifferenzierung, den Zellwachstums und Zell-reparaturwegen, der Mitochondrienfunktion und der synaptischen Übertragung. Die Wechselwirkung von L1 mit diesen Proteinen zeigt, dass die proteolytische Spaltung L1 mit mehreren Funktionen ausstattet, die eine Rolle bei der Pathogenese vieler neuronaler Erkrankungen spielen könnten.