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Titel: Entwicklung und Evaluierung von rekombinanten Antikörpern zur Detektion von Trinitrotoluenderivaten
Sonstige Titel: Development and evaluation of recombinant antibodies for the detection of trinitrotoluen derivatives
Sprache: Deutsch
Autor*in: Simonovic, Mladen
Schlagwörter: TNT TNP rekombinante Antikörper; TNT TNP recombinant antibodies
GND-Schlagwörter: Biochemie
Erscheinungsdatum: 2004
Tag der mündlichen Prüfung: 2004-12-20
Zusammenfassung: 
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, neuartige rekombinante Immunoreagenzien zur Detektion von Trinitrotoluen-Derivaten als Modellhaptene zu generieren, und miteinander zu vergleichen. Dabei standen unterschiedliche anti-TNT-scFvs zur Verfügung: der 11B3-scFv, murinen Ursprungs, und der 3.5-scFv, der aus einer humanen synthetischen Bibliothek generiert worden war. Auf der Basis dieser zwei Fragmente wurden mono-, bi- und polyvalente rekombinante Immunoreagenzien in pro- und eukaryotischen Expressionssystemen generiert, um den Einfluß der Valenz und Molekülgröße auf die Antigenbindung in Immunoassays zu untersuchen. scFv-Gene wurden in geeignete Vektoren eingebracht und die monovalenten ScFv-Proteine in E.coli exprimiert. Mittels Affinitätschromatographie wurden die scFvs gereinigt und in einem Assay in Hinsicht auf ihr Bindungsverhalten charakterisiert. Bivalente Antikörper in Form von IgGDC1-Molekülen wurden durch Insertion der scFv-Gene in eine Expressionskassete erzeugt, die die CH2- und CH3-Regionen der humanen schweren Kette des IgG-Moleküls enthielt. Diese Antikörper wurden in Säugerzelllinien HEK 293 exprimiert, über affinitätschromatographische Verfahren gereinigt und hinsichtlich ihrer Affinität und Bindungseigenschaften in einem Assay zum Nachweis von TNBS getestet. Weiterhin wurden ausgehend von den beiden scFvs bifunktionelle Fusionsproteine konstruiert, die eine direkte enzymatische Detektion durch die ß-Lactamase als Fusionspartner ermöglichten. Die Funktionalität des scFvs und die enzymatische Aktivität der ß-Lactamase wurden durch den Nachweis von TNBS bestätigt. Weiterhin wurden filamentöse Phagen produziert, die nicht nur den spezifischen scFv in mono- und pentavalenter Form, sondern auch die ß-Lactamase als Fusionspartner ihrer Hüllproteine trugen. Die Funktionalität der Phagen konnte in einem Immunoassay verifiziert werden. Mit einer Detektionsgrenze von 250 pM TNBS-Lösung erwiesen sich die beiden IgGDC1-Moleküle in einem kompetitiven ELISA als sensitivste Immunoreagenzien.

The aim of this work was to generate novel recombinant immunoreagents for detection of trinitrotoluene derivatives as model haptens and to compare them with each other. Thereby were two different anti-TNT-scFvs available: 11B3-scFv, with the mouse origin, and 3.5-scFv, which was obtained from a synthetic human scFv-library. Various mono-, bi- und polyvalent recombinant immunoreagents were produced in pro- and eucaryotic expression systems on the basis of these genes, in order to examine the influence of the valency and molecule dimension on the antigen binding. The scFv genes were cloned in the suitable vectors and the monovalent scFv proteins were expressed in E.coli. Using affinity chromatography the scFv proteins were purified and analysed in an assay concerning their binding characteristics. Bivalent antibodies in the form of IgGDC1 molecules were generated by the insertion of the scFv genes in the expression cassette, that contained the CH2 and CH3 regions of the human heavy chain of the IgG molecule. These antibodies were expressed in the mammalian cell line HEK 293, purified using affinity chromatography and tested in an assay for the detection of TNBS regarding their affinity and binding characteristics. Further on bifunctional fusion proteins were constructed based on the two scFvs. They enabled a direct enzyme detection by the ß-lactamase as a fusion partner. The functionality of the scFvs and the enzymatic activity of the ß-lactamase were verified by the detection of TNBS. Further, the filamentous phages were produced, that not only exposed the specific scFv in a mono- and pentavalent form on the surface, but also the ß-lactamase as a fusion partner of their coat proteins. The functionality of the phages was confirmed in an immunoassay. Both IgGDC1 proved to be the most sensitive immunoreagents with the detection limit of 250 pM TNBS solution in the competitive ELISA.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/851
URN: urn:nbn:de:gbv:18-23666
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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