Analysis of function and signaling pathway of guanine nucleotide exchange factor DOCK1 in acute myeloid leukemia

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a malignant disease of the hematopoietic system and is characterized by immature myeloid cell proliferation, leading to bone marrow failure. Despite intensive chemotherapy, prognosis for patients remains unsatisfactory and new therapeutic approaches are needed. The bone marrow niche is a key player in the pathogenesis of AML and home of the leukemic stem cells (LSCs), which are believed to be responsible for leukemic relapse due to their resistance to chemotherapy. Microarray-based gene expression analysis of co-cultured primary AML blasts with endothelial cells revealed the Rac Guanine nucleotide exchange factor (GEF) DOCK1 (Dedicator of cytokinesis 1) as a possible component in the interaction between the bone marrow niche and AML cells. As a GEF, DOCK1 has a critical role in various cellular processes such as phagocytosis, cell migration and invasion. Further analysis of published gene expression data of a large cohort of AML patients (n = 290) identified DOCK1 as an independent prognostic marker, since high DOCK1 expression was associated with poor overall survival as well as poor event-free survival. These findings are in line with a recently published study by Lee et al.. Aim of this project was to evaluate the influence of DOCK1 to the pathophysiology of AML and to identify potential members of the DOCK1-signaling pathway. The antileukemic effect of DOCK1 inhibition or downregulation was assessed in in vitro assays. Furthermore, the overexpression of DOCK1 as well as the downregulation of DOCK1 binding partner engulfment and cell motility protein 1 (ELMO1) was evaluated. To investigate the antileukemic effect of DOCK-inhibition with small molecule inhibitors TBOPP and CPYPP, proliferation and colony formation assays, using the DOCK1 expressing AML cell lines TF-1 and UKE-1 were performed. Functional and stable DOCK1 and ELMO1 knockdown in TF-1 and UKE-1 cells were generated by using specific shRNAs in a lentiviral vector system, which additionally allows a fluorescent labeling of the cells. Following knockdown confirmation by RT-qPCR and Western Blot, functional assays to analyze the proliferation, colony formation and adhesion properties were performed. Assessment of proliferative and clonogenic properties demonstrated an antileukemic effect in AML cells only for the treatment with the DOCK-inhibitors TBOPP and CPYPP. The decreased proliferation and colony formation could not be reproduced by shRNA-based knockdown of DOCK1 or its binding partner ELMO1, indicating that other DOCK variants may be additionally involved in the antileukemic effect of the small molecule inhibitors. Furthermore, functional assays with DOCK1-overexpressing cells underlined the assumption that DOCK1-expression is not essential for the functional properties of malignant cells in AML in vitro. Based on preliminary data, a role of DOCK1 for the homing and retention of AML cells within the bone marrow niche can be assumed. To investigate the effect of the DOCK1 knockdown or overexpression in vivo, transduced cells were transplanted intravenously into immunodeficient NSG or NSGS mice. Although murine xenograft models confirmed the in vitro findings by showing no survival benefit for DOCK1 deficient AML, it was clearly demonstrated that there is a relevance of DOCK1 in vivo, since distinct differences between DOCK1- expressing cells and DOCK1-deficient cells were revealed. DOCK1 expression in AML cells led to a greater promotion of splenomegaly and a higher early leukemic infiltration as well as hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) egress from the bone marrow. The underlying mechanisms and the consequences for the course of the disease remain still unknown. Possibly certain genes or proteins, which have been identified by RNA-sequencing or mass spectrometric analysis, might be involved in the DOCK1-mediated effects. Further detailed investigations are necessary to understand the impact and relevance of the DOCK1-induced phenomena.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung des hämatopoetischen Systems, die durch die Zellproliferation von unreifen myeloischen Vorläuferzellen und letztlich die Verdrängung der normalen Hämatopoese charakterisiert ist. Trotz intensiver Chemotherapie ist die Prognose für die Patienten nach wie vor unbefriedigend und neue Therapieansätze sind dringend erforderlich. Die Knochenmarknische nimmt eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der AML ein und ist Ort der Ansiedelung für leukämische Stammzellen (LSCs), welche aufgrund ihrer Chemotherapie-Resistenz für das Auftreten von Rezidiven verantwortlich gemacht werden. Microarray-basierte Genexpressions-Analysen von co-kultivierten AML Blasten mit Endothelzellen haben das Gen DOCK1 (Dedicator of cytokinesis 1), welches für den Rac Guanine nucleotide exchange factor (GEF) DOCK1 kodiert, als möglichen Bestandteil in der Interaktion zwischen Zellen der Knochenmarknische und den AML-Zellen identifizieren. Als GEF spielt DOCK1 bei vielen verschiedenen zellulären Prozessen, wie der Phagozytose, der Zellmigration sowie Invasion, eine wichtige Rolle. Weiterhin hat die Analyse von publizierten Genexpressions-Daten einer großen Kohorte von AML-Patienten (n = 290) DOCK1 als unabhängigen prognostischen Marker identifiziert, da eine hohe DOCK1-Expression sowohl mit einem schlechten Gesamtüberleben als auch mit einem schlechten ereignisfreien Überleben assoziiert war. Diese Schlussfolgerung entspricht den Ergebnissen einer kürzlich veröffentlichten Studie von Lee et al.. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von DOCK1 in der Pathophysiologie der AML zu evaluieren sowie mögliche Mitglieder der DOCK1- Signalkaskade zu identifizieren. In in vitro-Assays wurde die anti-leukämische Wirkung der Inhibition oder der genetischen Herunterregulierung von DOCK1 untersucht. Weiterhin wurde die Überexpression von DOCK1 sowie der Knockdown von ELMO1, dem Bindungspartner von DOCK1, betrachtet. Um die anti- leukämische Wirkung der DOCK-Inhibition mit den kleinmolekularen Inhibitoren TBOPP und CPYPP zu untersuchen, wurden Proliferations- sowie Koloniebildungsassays mit den DOCK1- exprimierenden AML-Zelllinien TF-1 und UKE-1 durchgeführt. Um einen funktionellen und stabilen DOCK1- sowie ELMO1-Knockdown in TF-1- und UKE-1-Zellen zu erzeugen, wurden spezifische shRNAs in einem lentiviralen Vektorsystem, das zusätzlich eine Fluoreszenzmarkierung der Zellen erlaubt, verwendet. Nach der Verifizierung des Knockdowns durch RT-qPCR und Western Blot wurden funktionelle Assays zur Analyse der Proliferations-, Koloniebildungs- und Adhäsionseigenschaften durchgeführt. Die Bestimmung der proliferativen und klonogenen Eigenschaften zeigte eine anti-leukämische Wirkung in AML- Zellen nur für die Behandlung mit den DOCK-Inhibitoren TBOPP und CPYPP. Die verminderte Proliferation sowie Koloniebildung konnte durch den shRNA-vermittelten Knockdown von DOCK1 oder seinem Bindungspartner ELMO1 nicht reproduziert werden, woraus sich schließen lässt, dass andere DOCK-Varianten zusätzlich an der anti-leukämischen Wirkung der kleinmolekularen Inhibitoren beteiligt sein könnten. Darüber hinaus bekräftigten funktionelle Assays mit DOCK1-Überexpressions-Zellen die Annahme, dass die DOCK1-Expression für die funktionellen Eigenschaften maligner Zellen bei der AML in vitro nicht essentiell ist. Auf der Grundlage vorläufiger Daten, kann eine Funktion für DOCK1 bei dem Homing und die Retention von AML-Zellen innerhalb der Knochenmarknische angenommen werden. Um den Effekt eines DOCK1-Knockdowns oder einer -Überexpression in vivo zu untersuchen, wurden transduzierte Zellen intravenös in NSG- oder NSGS-Mäuse transplantiert. Obwohl die murinen Xenotransplantat-Modelle die in vitro-Daten bestätigten, indem sie keinen Überlebensvorteil für eine DOCK1-defiziente AML zeigten, konnte eindeutig demonstriert werden, dass DOCK1 eine Relevanz in vivo besitzt, da deutliche Unterschiede zwischen DOCK1-exprimierenden und DOCK1-defizienten Zellen nachgewiesen werden konnten. Die DOCK1-Expression in AML- Zellen führte zu einer verstärkten Splenomegalie, einer höheren frühen Infiltration des Knochenmarks durch AML-Zellen sowie einem stärkeren Austritt von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aus dem Knochenmark. Die zugrundeliegenden Mechanismen und die Folgen für den Krankheitsverlauf sind nach wie vor unbekannt. Möglicherweise könnten bestimmte Gene oder Proteine, die im Rahmen dieser Arbeit durch RNA-Sequenzierung oder massenspektrometrischer Analyse identifiziert wurden, an den DOCK1-vermittelten Effekten beteiligt sein. Weitere detaillierte Untersuchungen sind notwendig, um die Auswirkungen und die Relevanz der DOCK1-induzierten Phänomene zu verstehen.