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Titel: Identification of novel antivirals targeting the human cytomegalovirus alkaline nuclease pUL98
Sonstige Titel: Identifizierung von neuen antiviralen Substanzen gegen der alkalischer Nuklease pUL98 des menschlichen Cytomegalievirus
Sprache: Englisch
Autor*in: Potgieter, Theodore I.
Schlagwörter: UL98; alkalische Nuklease; antiviralen Substanzen; Virostatika; UL98; alkaline Nuclease; antivirals
GND-Schlagwörter: Cytomegalie-Virus; High throughput screening; Fluorophore
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-11-15
Zusammenfassung: 
Human cytomegalovirus (HCMV) is a leading cause of congenital sequelae in neonates and causes serious disease in immunocompromised patients. A vaccine against HCMV is not available, and current treatment of HCMV largely focuses on interfering with viral DNA replication or viral genome packaging; however, side effects are common and viral strains resistant to these treatments have been reported, indicating a need for new viral therapeutic targets. The viral alkaline nuclease, an enzyme conserved in all herpesvirus subfamilies, is considered a potential target. In HCMV, this is encoded by the UL98 gene. Several HCMV-UL98 mutants which impact the activity of the alkaline nuclease were generated and shown to severely impair viral replication. This suggests that UL98 is essential for viral growth and is a suitable target for antiviral treatment. To test this hypothesis UL98 was cloned in the pET28b(+)/BL21(DE3) expression system and purified in order to design a fluorescence assay that makes use of a DNA oligonucleotide substrate coupled to a fluorophore and a quencher. Upon degradation by the viral nuclease, fluorophore and quencher are separated resulting in an increase in detectable fluorescence, allowing for the quantification of pUL98 activity. As a proof of principle of the fluorescence assay pUL98 nuclease activity was reduced in this system by a known inhibitor, Atanyl Blue PRL (Acid Blue 129), in a dose-dependent manner.
The system was then used to screen 27,690 compounds in the Small Compound Library at the Medizinische Hochschule Hannover. This led to the identification of several compounds which strongly inhibited the purified UL98 activity. The inhibitory activities of the identified compounds were verified, further characterized and were tested for cell toxicity, while inhibition of viral replication was screened by plaque reduction assay. Two compounds show promise as potential inhibitors of HCMV replication: Compound A and Compound D. While compound D was only tested against HCMV, compound A was tested against HCMV, HSV-1 and MCMV and showed reduction of viral growth. Several structural derivatives of Compound A were then investigated in order to improve its efficacy against HCMV infection in vitro as well as reduce its toxicity. One such derivative, AD-51, showed greatly improved efficacy compared to Compound A and demonstrates the requirements of a good preliminary lead compound for HCMV treatment.
This study aims to serve as a stepping stone for the creation of a new class of antivirals against the herpesviruses that do not target the viral replication or packaging pathways.

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist eine der Hauptursachen für angeborene Schäden bei Neugeborenen und verursacht schwere Erkrankungen bei immunsupprimierten Patienten. Ein Impfstoff gegen das HCMV ist bisher nicht verfügbar und die derzeitigen Behandlungen von HCMV-infizierten Patienten konzentrieren sich weitgehend auf die Beeinträchtigung der viralen DNA-Replikation oder der Verpackung des viralen Genoms. Jedoch sind diese Therapieansätze häufig mit starken Nebenwirkungen belastet und es kommt mitunter zu Resistenzen der viralen Stämme gegen diese Behandlungen, was auf die Notwendigkeit neuer viraler therapeutischer Ziele hinweist.
Die virale alkalische Nuklease, ein in allen Herpesvirus-Unterfamilien konserviertes Enzym, gilt als potenzielles Ziel. Bei HCMV wird dies durch das UL98-Gen kodiert. Mehrere HCMV-UL98-Mutanten konnten erzeugt werden, die die Virusreplikation nachweislich beeinflussten. Dies deutet darauf hin, dass das UL98 für das Viruswachstum essentiell ist und ein geeignetes Ziel für eine antivirale Therapie darstellt. Um diese Hypothese im Detail zu überprüfen, wurde das UL98-Gen in das pET28b(+)/BL21(DE3)-Expressionssystem geklont und gereinigt. Zudem wurde ein Fluoreszenztest entwickelt, welcher ein DNA-Oligonukleotidsubstrat, gekoppelt mit einem Fluorophor und Quencher, verwendet, um eine Quantifizierung der pUL98-Aktivität zu ermöglichen. Der Abbau des Substrates durch die virale Nuklease resultiert in der Trennung vom Fluorophor und Quencher, wodurch es zu einer Erhöhung der Fluoreszenz kommt, die durch einen ELISA-Reader nachgewiesen werden kann. Als Inhibierungskontrolle des Assays diente ein bereits bekannten Inhibitor, namentlich Atanyl Blue PRL (Acid Blue 129), der die Nukleaseaktivität von pUL98 konzentrationsabhängig reduzieren kann. Mit diesem System wurden 27.690 Substanzen in der Small Compound Library der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) untersucht. Dies führte zur Identifizierung mehrerer Substanzen, die die Nukleaseaktivität von pUL98 stark hemmten. Die potentiellen Inhibitoren wurden nachfolgend verifiziert, charakterisiert und auf Zelltoxizität überprüft. Zudem wurde die mögliche Hemmung der Substanzen auf die virale Replikation in Plaque-Reduktionstests analysiert. Zwei Substanzen konnten als vielversprechend eingestuft werden: Compound A und Compound D. Während Compound D nur gegen HCMV getestet wurde, konnte mit Compound A eine Reduktion der viralen Replikation gegen das HCMV, HSV-1 und MCMV gezeigt werden. Anschließend wurden mehrere Strukturderivate von Compound A in vitro untersucht, um die Wirksamkeit gegen HCMV-Infektionen zu verbessern und die Toxizität zu minimieren. Ein solches Derivat, AD-51, zeigte eine deutlich verbesserte Wirksamkeit im Vergleich zu Compound A und demonstriert die Anforderungen an eine gute vorläufige Leitsubstanz für eine zukünftige HCMV Therapie.
Diese Studie soll als Sprungbrett für die Entwicklung einer neuen Klasse von Virostatika gegen Herpesviren dienen, die nicht auf die virale Replikation oder die Verpackungswege abzielen.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8549
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-86685
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Brune, Wolfram (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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