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Titel: Assessing tRNA sequence flexibility using semi de novo designed nonsense suppressor tRNAs
Sonstige Titel: Analyse der Sequenzflexbilität von tRNAs mittels semi de novo designten Nonsense Suppressor tRNAs
Sprache: Englisch
Autor*in: Albers, Suki
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-09-20
Zusammenfassung: 
Nonsense suppressor tRNAs are useful tools in understanding tRNA functionality and evolutionary constraints of this commonly shaped molecule. In contrast to native elongator tRNAs, competition with other tRNA isodecoders is abolished in cells lacking natural nonsense suppressor tRNAs. Thus, evaluation of single nucleotide as well as whole motif swaps on the performance of tRNA in translation is facilitated. This study aims at identifying nucleotides or regions that are major determinants of the functionality of nonsense suppressor tRNAs. Nonsense suppressor tRNA construction started with a semi de novo design, which preserved recognition elements for E. coli Alanyl-tRNA synthetase, bases involved in tertiary interactions defined from the crystal structure of unmodified E. coli tRNAPhe and a stop anticodon. The other bases were chosen to match the highest probability to form the cloverleaf secondary structure. The resulting designs n1-n6, even though aminoacylated, except n2, proved to be non-functional. Interestingly, n2 contained the G3-U70 wobble base pair, which serves as main identity element of tRNAAla, but could not be charged with Ala. Exchange of the 6-67 and/or 7-68 base pair of n2 reestablished recognition by AlaRS.
An investigation of the anticodon loop of native elongator tRNAs from different species has shown that nucleotides surrounding the anticodon triplet are rather conserved. Subsequent nucleotide exchanges of the anticodon loop according to the most frequent bases occurring in these positions, led to the designs n1A1-n1A3 and n3A1-n3A3. However, the resulting nonsense suppressor tRNA designs did also not promote stop codon read-through. In contrast, tRNAAla(UCA(U)), generated by replacing the anticodon triplet of a native tRNAAla(UGC) isoacceptor by the opal stop anticodon, promoted GFP expression. This suggested that the anticodon context of tRNAAla(UCA(U)) might be more suitable for nonsense suppression. Thus, designs n1A3_A37-n1A5 were produced by exchanging the anticodon loop of n1A3 with that found in tRNAAla(UCA(U)). Again, nonsense suppression levels were close to background values. All attempts to increase nonsense suppression by anticodon loop exchanges were unsuccessful. This suggested that other tRNA regions than the anticodon were responsible for the lack of functionality.
During translation elongation, tRNAs are delivered to the ribosomal A-site as a ternary complex with EF-Tu and GTP. EF-Tu binding is finely tuned for a specified tRNA body and its esterified amino acid in order to achieve uniform binding of elongator tRNAs. The binding affinity of tRNAs to EF-Tu is mainly determined by the three TΨC-stem base pairs 49-65, 50-64, 51-63. Because all designs contained recognition elements of Alanyl-tRNA synthetase and thus, should be aminoacylated with Ala, the TΨC-stem base pairs of native tRNAAla(UGC) were inserted into n1A3. Interestingly, the resulting design TS1 did not promote nonsense suppression. A further increase in EF-Tu binding affinity was achieved by substituting the TΨC-stem base pairs with that found in tRNAGluE2. Design TS2 served as active nonsense suppressor tRNA, reaching 8.7 ± 0.9% suppression, as compared to the wildtype GFP. Combinatorial insertion of the D-region and TΨC-stem base pairs of tRNAPro1 and tRNAGluE2, respectively, increased read-through levels to 15.2 ± 2.4%, which were higher than those observed for tRNAAla(UCA(U)) with 12.3 ± 3.4%. Incorporation of only the D-region of tRNAPro1 into n1A3, design D1, showed nonsense suppression near to the background level. Increase of the variable region of TS2 and DTS2, e.g. similar to that found in E. coli tRNASec, abolished nonsense suppression, while substitution of G37 by A37 was lethal to E. coli cells.
Taken together, the results show that incorporation of the TΨC-stem base pairs of tRNAGluE2 and therefore high EF-Tu binding affinity promoted PTC read-through of the semi de novo designed nonsense suppressor designs used in this study. In contrast to previous studies, editing of the anticodon region or extension of the variable region did not stimulate nonsense suppression. Thus, the TΨC-stem exhibited the largest effect on the nonsense suppression efficiency, while other tRNA regions, such as the D-region, rather fine-tuned the read-through levels.

Nonsense Suppressor tRNAs sind wertvolle Werkzeuge, um die Funktionalität und evolutionäre Antriebskraft zur Ausbildung der L-Struktur von tRNAs zu untersuchen. Im Gegensatz zu natürlichen Elongator tRNAs besteht in Zellen, die keine natürlichen Suppressor tRNAs exprimieren, keine Konkurrenz zu anderen tRNA Isodekodern. Dies erleichtert es, den Einfluss des Austausches einzelner Nukleotide sowie ganzer Motive auf die Partizipation von tRNAs in der Proteinbiosynthese zu evaluieren. Das Ziel dieser Studie ist es, Nukleotide oder Regionen, welche die Funktionalität von Nonsense Suppressor tRNAs maßgeblich beeinflussen, zu identifizieren. Die Konzeption der Nonsense Suppressor tRNAs begann mit einem semi de novo Design. Dies beinhaltete Erkennungselemente von E. coli Alanyl-tRNA Synthetase, Basen, die in tertiären Interaktionen involviert sind und anhand der Kristallstruktur der unmodifizierten E. coli tRNAPhe identifiziert wurden, sowie das Stop Anticodon. Die verbliebenen Basen wurden entsprechend der höchsten Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung der Kleeblatt tRNA Sekundärstruktur ausgewählt. Die resultierenden Designs n1-n6, wurden zwar aminoacyliert, mit Ausnahme von n2, waren jedoch nicht funktionell. Interessanterweise beinhaltete n2 das Haupterkennungselement von tRNAAla, das G3-U70 Wobble Basenpaar, wurde jedoch trotzdem nicht mit Ala beladen. Substituierung des 6-67 und/oder 7-68 Basenpaares stellte die Beladung durch AlaRS wieder her.
Eine Untersuchung von nativen Elongator tRNAs aus verschiedenen Organismen hat gezeigt, dass die Nukleotide innerhalb der Anticodonschleife, mit Ausnahme des Anticodon-Triplets, eher konserviert sind. Subsequenter Austausch der Nukleotide in der Anticodonschleife von n1 und n3 durch Nukleotide, die mit den höchsten Häufigkeiten an den entsprechenden Positionen vorkommen, führte zu den Designs n1A1-n1A3 und n3A1-n3A3. Die erhaltenen Designs waren jedoch inaktiv als Nonsense Suppressoren. Im Gegensatz dazu führte tRNAAla(UCA(U)), erhalten durch Transplantation des Opal Anticodon-Triplets in native tRNAAla(UGC), zu GFP Expression. Dies ließ vermuten, dass der Anticodon Kontext von tRNAAla(UCA(U)) geeigneter ist für die Nonsense Suppression. Somit wurden durch Austausch der Anticodonschleife von n1A3 entsprechend zu tRNAAla(UCA(U)) die Designs n1A3_A37-n1A5 generiert. Jedoch waren die Nonsense Suppression Level dieser Designs nicht höher als der Hintergrund, gemessen in Abwesenheit von Nonsense Suppressor tRNAs. Alle Versuche, die Nonsense Suppresssion durch Änderungen innerhalb der Anticodonschleife der tRNA herzustellen, waren nicht erfolgreich. Dies zeigte, dass andere tRNA Regionen für die mangelnde Funktionalität verantwortlich sind.
Während der Elongation der Translation werden tRNAs in Form eines ternären Komplexes mit EF-Tu und GTP zur ribosomalen A-Stelle transportiert. Die Bindungsaffinität einer tRNA mit seiner esterifizierten Aminosäure zu EF-Tu ist ausbalanciert, um eine uniforme Bindung von Elongator Aminoacyl-tRNAs während der Translation zu ermöglichen. Die Bindung von aa-tRNAs zu EF-Tu wird hauptsächlich durch die Sequenz der drei TΨC-Stamm Basenpaare 49-65, 50-64, 51-63 determiniert. Da alle Designs die Erkennungselemente für die Beladung durch Alanyl-tRNA Synthetase beinhalteten und daher mit Ala beladen werden sollten, wurden die drei TΨC-Stamm Basenpaare von nativer tRNAAla(UGC) in n1A3 transplantiert. Interessanterweise führte das resultierende Design TS1 nicht zur Suppression von Stop Codons. Eine weitere Erhöhung der Bindungsaffinität zu EF-Tu wurde durch Substituierung der TΨC-Stamm Basenpaare von n1A3 durch solche präsent in tRNAGluE2 erreicht. Das Design TS2 fungierte als aktive Nonsense Suppressor tRNA mit Suppressionslevels von 8.7 ± 0.9% im Vergleich zu Wildtyp GFP. Gemeinsame Insertion der D-Region von tRNAPro1 und der TΨC-Stamm Basenpaare von tRNAGluE2, wie in DTS2, erhöhte das Nonsense Suppression Level auf 15.2 ± 2.4%, welches höher war als das von tRNAAla(UCA(U)) mit 12.3 ± 3.4%. Inkorporierung der D-Region alleine, Design D1, zeigte Nonsense Suppression ähnlich zum Hintergrund Level. Eine Verlängerung der variablen Region von TS2 und DTS2, z.B. ähnlich wie präsent in E. coli tRNASec, hob die Nonsense Suppression wieder auf. Substituierung von G37 durch A37 innerhalb von TS2 und DTS2 war letal für die E. coli Zellen.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Inkorporierung der TΨC-Stamm Basenpaare von tRNAGluE2 und daher eine starke Bindungsaffinität zu EF-Tu sich positiv auf die Funktionalität der in dieser Studie verwendeten semi de novo designten Nonsense Suppressor tRNAs auswirkte. Im Gegensatz zu vorherigen Studien erhöhten Veränderungen innerhalb der Anticodonregion oder eine Verlängerung der variablen Region die Nonsense Suppressionslevel nicht. Somit bestimmte der TΨC-Stamm die Nonsense Suppressioneffizienz maßgeblich, während andere tRNA Regionen, wie z.B. die D-Region, eher zum Fine Tuning der Nonsense Suppressionslevel beigetragen haben.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8553
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-86722
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Ignatova, Zoya (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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