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Titel: Visualization of effector protein translocation and pore formation during Yersinia enterocolitica infection of cells
Sonstige Titel: Visualisierung der Effektorprotein-Translokation und Porenbildung während der Infektion von Zellen mit Yersinia enterocolitica
Sprache: Englisch
Autor*in: Rudolph, Maren
Schlagwörter: Typ-3-Sekretionssystem; Effektorprotein; YopM; YopH; YopE; YopB; YopD; selbst-markierende Enzyme; split-GFP; ALFA-tag; Nanokörper; Type III secretion system; effector protein; YopM; YopH; YopE; YopB; YopD; self-labeling enzymes; split-GFP; ALFA-tag; nanobody
GND-Schlagwörter: Yersinia enterocolitica; Mikroskopie; Infektion; Pore; Translokation; Sekretion; Klonierung
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-08-06
Zusammenfassung: 
Yersinia enterocolitica employs a type three secretion system (TTSS; injectisome) in order to translocate effector proteins into host cells. The effectors (Yersinia outer proteins, Yops H,O,P,E,M,T and Q) manipulate host cell functions to support the infection strategy of the bacteria. Extensive research elucidated the function and structure of the TTSS and to a lesser extent of the associated translocation pore. The two pore proteins (YopB, YopD) are translocated themselves by the TTSS and then form a heterodimeric pore complex in the host cell membrane that acts as an entry gate for the bacterial effectors. Until now, a real time visualization of translocation pore formation or effector protein translocation in host cells by an active TTSS has been very challenging. Several approaches have been developed in this regard but most displayed critical limitations such as incompatibility with live cell imaging, insufficient resolution and sensitivity or disturbance of protein and TTSS function.
In this study different approaches for visualizing pore- and effector proteins of Y. enterocolitica injectisomes in action were investigated. Tagging of the effectors YopH, YopM and YopE with the self-labeling enzymes Halo, SNAP and CLIP showed a strong inhibitory effect on overall Yop secretion and translocation. In comparison, a split-GFP approach for tagging YopE allowed the visualization of YopE translocation into HeLa cells and primary human macrophages. However, tagging of the pore proteins YopB and YopD with the smaller part of split-GFP did not produce satisfactory results. Finally, by employing a CRISPR-Cas12a assisted recombination approach a small peptide tag (ALFA-tag) was inserted into a region of the YopD protein that is thought to lie extracellularly when Yop is integrated in the translocation pore. In a cell infection assay using Y. enterocolitica expressing ALFA-tagged YopD and an extracellularly applied fluorophore-labeled nanobody, the nanobody allowed live cell imaging of nascent and seemingly fully functional translocation pores. Thus, this assay allowed for the first time the visualization of injectisomes while forming translocation pores during cell infection. Onset of pore formation occurred directly after uptake of the bacteria into a PI(4,5)P2-enriched prevacuole. After maturation of the bacteria-containing prevacuole into a phagosome, damaging of the phagosomal membrane by the bacterial pores could be visualized with help of the marker protein GFP-galectin-3. Altogether this work allowed for the first time to visualize in real time the formation of TTSS translocation pores.

Yersinia enterocolitica verwendet ein Typ-3-Sekretionssystem (TTSS; Injektisom), um Effektorproteine in Wirtszellen zu translozieren. Die Effektoren (Yersinia outer proteins, Yops H,O,P,E,M,T und Q) manipulieren Funktionen der Wirtszelle, um die Infektionsstrategie des Bakteriums zu unterstützen. Umfangreiche Forschungsarbeiten haben die Funktion und Struktur des TTSS und in geringerem Maße der angehefteten Translokationspore untersucht. Die beiden Porenproteine (YopB, YopD) werden durch das TTSS selbst transloziert und bilden dann einen heterodimeren Porenkomplex in der Wirtszellmembran als der als Eintrittspforte für die bakteriellen Effektoren dient. Bisher war die Echtzeit-Visualisierung der Porenbildung bzw. der Effektorprotein-Translokation in Wirtszellen nur schwer möglich. Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, die meisten zeigten jedoch kritische Einschränkungen wie Inkompatibilität mit der Bildgebung in lebenden Zellen, unzureichende Auflösung und Empfindlichkeit oder Störung der Protein- und TTSS-Funktionen.
In dieser Studie wurden verschiedene Ansätze zur Visualisierung von Poren- und Effektorproteinen von Y. enterocolitica Injektisomen untersucht. Die Markierung der Effektoren YopH, YopM und YopE mit den selbstmarkierenden Enzymen Halo, SNAP und CLIP zeigte eine starke hemmende Wirkung auf die gesamte Yop-Sekretion und -Translokation. Im Vergleich dazu erlaubte ein Split-GFP-Ansatz zur Markierung von YopE die Visualisierung der YopE-Translokation in HeLa-Zellen und primären menschlichen Makrophagen. Die Markierung der Porenproteine YopB und YopD mit dem kleineren Teil des Split-GFP erwies sich jedoch als ungeeignet. Schließlich wurde mit Hilfe eines CRISPR-Cas12a-assistierten Rekombinationsansatzes ein kleiner Peptid-Tag (ALFA-Tag) an einer Stelle von YopD eingefügt, die vermutlich im extrazellulären Teil des Proteins liegt, wenn dieses eine Translokationspore in der Wirtszellmembran gebildet hat. In einem Zellinfektionsversuch mit Y. enterocolitica, das ALFA-gekoppelte YopD exprimiert und einem extrazellulär applizierten Fluorophor-markierten Nanokörper, konnten naszierende und funktionelle Translokationsporen sichtbar gemacht werden. Damit ermöglichte dieser Assay zum ersten Mal die Live-Bildgebung von Injektisomen bei der Bildung von Translokationsporen während einer Zellinfektion. Der Beginn der Porenbildung erfolgte direkt nach der Aufnahme der Bakterien in eine PI(4,5)P2-angereicherte Prä-Vakuole. Nach Reifung der bakterienhaltigen Prä-Vakuole zu einem Phagosom konnte mit Hilfe des Markerproteins GFP-Galectin-3 eine Schädigung der Phagosomenmembran durch die bakteriellen Poren sichtbar gemacht werden. Insgesamt ermöglichte diese Arbeit zum ersten Mal die Echtzeit-Visualisierung der Bildung von TTSS-Translokationsporen während der Wirtszellinfektion.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8563
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-86825
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Aepfelbacher, Martin (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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