Multifunktionale Siderophore als Metallchelatoren für die PET Diagnostik

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Synthese modularer, peptidischer Hydroxamate als Chelatoren für die Entwicklung neuer und individuell anpassbarer 89Zr-basierter Kontrastmittel für die PET-Diagnostik. Das Radiometall 89Zr hat sich im Laufe der letzten Dekade, im Kontext der Antikörper-gestützten immunoPET, aufgrund seiner vorteilhaften Halbwertszeit und Zerfallseigenschaften als Radionuklid der Wahl etabliert. Als Vorbild für die Entwicklung eines neuen Liganden für 89Zr diente in dieser Arbeit der Naturstoff Desferrioxamine (DFO), ein acyclisches Pseudopeptid aus der Gruppe der Siderophore. DFO ist in der Lage über seine drei Hydroxamsäuregruppen Übergangsmetallkationen zu chelatisieren, während das freie Amin eine Konjugation an Targeting-Funktionen zulässt. In Anlehnung an den Naturstoff wurde ein modulares Peptid-Grundgerüst entwickelt, welches neben den Möglichkeiten zur Komplexierung von Metallkationen und der Konjugation weiterer Biomoleküle durch die Verwendung von α-Diaminosäuren eine zusätzliche Funktionalisierung zulässt, um beispielsweise die pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung zu beeinflussen. Für die Synthese der Dipeptid-Bausteine für das Peptidrückgrat des späteren Liganden, konnte eine robuste und effiziente Synthesesequenz ausgehend von den kommerziell erhältlichen Boc-, Cbz-geschützten Diaminosäuren L-Ornithin bzw. L-Lysin und β-Alanin etabliert werden. Als weitere Variation zum Vergleich eines Einflusses der Positionierung der Hydroxamsäurefunktion innerhalb des Moleküls sollte ein Ornithin-γ-GABA-Baustein dargestellt werden. Ausgehend von den Monomer-Bausteinen wurde anschließend mittels Peptidsynthese nach der Fmoc-Strategie nach einem Baukastenprinzip eine Bibliothek von insgesamt 9 Chelatoren mit unterschiedlichen Eigenschaften synthetisiert. Neben den dem DFO analogen hexadentaten Verbindungen, welche drei Hydroxamatgruppen tragen, wurde auch eine Reihe von vier octadentaten Chelatoren mit vier Hydroxamatgruppen dargestellt. Als weitere octadentate Variante wurden zusätzlich die hexadentaten Liganden mit einer freien Carbonsäurefunktion dargestellt. Die so erhaltenen Peptidgrundgerüste wurden im Anschluss zur Demonstration der Funktionalisierbarkeit via bioorthogonaler Click-Chemie mit zwitterionischen Gruppen modifiziert. Zur Evaluation der Stabilität der korrespondierenden Zr-Komplexe wurde ein HPLC-MS basierter Transchelatisierungsassay entwickelt. Während die trimeren Liganden in ihren Zr-Komplexen eine ähnliche Performance wie ihr Pendant DFO aufwiesen und bereits nach wenigen Stunden zerfielen, wiesen die Tetramere deutlich bessere Stabilitäten auf. Hierbei blieb der Komplex Tetramer-Orn-Zr auch nach 24 h vollständig stabil und wurde daher als potentielle Hit-Struktur in einer weiteren Studie validiert. Neben EDTA als Kompetitor wurde auch die Transchelatisierung gegen einen 300-fachen Überschuss an DFO untersucht, wobei eine Stabilität von mehr als 90% nach 24 h festgestellt werden konnte.

The aim of this thesis was the design and synthesis of novel, peptidic hydroxamate-ligands for the radiometal 89Zr as a modular platform for the development of specifically tuneable contrast agents for PET applications. Over the past decade, 89Zr emerged as the “metal of choice” for targeted immunoPET applications, due to its relatively long half-life time and favorable decay characteristics. The natural compound Desferrioxamine (DFO), an acyclic, pseudo peptidic siderophore, is the most popular chelator for 89Zr and has been employed in numerous, yet unsuccessful, clinical trials. DFO binds transition-metal ions via three hydroxamate groups and was used as archetype structure for the ligands developed in this thesis. In order to achieve complete modularity the ligands were designed as oligopeptides, allowing for a facile synthesis via standard peptide synthesis from readily available starting materials. The proposed final ligand structure offers four hydroxamate groups to fully saturate the coordination sphere of the Zr4+-ion, thus guaranteeing enhanced stability. It also offers additional side chains as modification sites to tune the pharmacokinetic properties of the ligand, for example by introducing zwitterionic groups, while allowing N- or C-terminal conjugation of targeting moieties. To ensure quick assembly of the ligands an efficient and robust synthetic route was established yielding dipeptidic monomer building blocks. Starting from commercially available Boc-, Cbz-protected diamino acids L-ornithine or L-lysine and β-alanine, two highly functionalised building blocks were synthesized. In order to investigate a possible influence of the intramolecular positioning of the hydroxamic acid moiety on the Zr-complex stability, an additional variation employing GABA instead of β-alanine. With the monomer building blocks at hand a library of nine chelators with varying properties were synthesized following peptide synthesis via the Fmoc-protocol in solution. As a comparison to the model compound DFO, hexadentate chelators, bearing three hydroxamic acids were synthesized. Additionally ocatadentate derivatives with four Hydroxamates or three hydroxamates as well as an additional carboxylic acid were synthesized. To demonstrate the modularity of the system, the azide side-chains were used to introduce zwitterionic groups via bioorthogonal click-chemistry. In order to evaluate the performance of the ligands in forming stable Zr-complexes a HPLC-MS transmetallation assay was developed. While the trimers employed insignificantly higher stabilities than the model compound DFO, the tetramers showed excellent stability in presence of the competitor EDTA. With nearly quantitative stability, the complex Tetramer-Orn-Zr remained intact after 24 h and was therefore identified as hit structure and validated in further transmetallation and kinetic studies. Besides its excellent stability in the presence of 1000 fold excess EDTA, the complex showed a very high stability of >90% after 24 h, when being opposed with a 300-fold excess of the current “Gold-standard” DFO, thus making it a potent candidate for further development of novel targeted 89Zr-contrast agents.