Identification of proteins involved in host cell cytosol uptake in the human Malaria parasite Plasmodium falciparum

Abstract

The apicomplexan parasite Plasmodium falciparum is the cause of the severest form of human malaria. The parasite propagates within human red blood cells (RBCs) where it grows until it fills out most of the host cell. During this growth phase the parasite ingests up to 80 % of the RBC cytosol. This host cell cytosol uptake (HCCU) serves as source for amino acids and provides room for parasite growth. The host cell cytosol consists mostly of hemoglobin that is transported to a lysosome-like organelle, the food vacuole (FV), where it is digested by a series of proteases. The toxic byproduct heme polymerizes to a hemozoin crystal, also termed the malaria pigment. While the digestive processes of hemoglobin in the FV are well understood, less is known how the host cell cytosol actually reaches the FV. Current models based on ultrastructural and inhibitor studies assume that HCCU is related to endocytosis but direct functional data implicating a specific protein in this process is lacking. In previous work a set of potential endocytosis proteins were identified in P. falciparum parasites but definite proof of a function of any of these proteins in HCCU is still lacking. Based on these preliminary data, three proteins, the PfClathrin heavy chain (CHC), PfEps15 and PfVPS45, were here chosen for analysis in more detail with the aim to experimentally demonstrate their role in HCCU and to reveal the first molecule in this process.

Taken together, this work reveals VPS45 as the first (to our knowledge) protein directly involved in HCCU. This molecule therefore represents an entry point to further characterize HCCU in P. falciparum. The function of Eps15 remains less clear but this protein may play a role in initial phases of HCCU. Importantly, this work shows that Eps15 interacts with the Artemisinin resistance marker Kelch13 that for instance may constitute a regulatory complex for endocytosis in P. falciparum. In contrast, the Clathrin Heavy Chain, an important element of endocytosis in eukaryotic organisms, has no function in endocytosis in P. falciparum, but rather plays a role at the Golgi, in agreement with the role of Clathrin in the apicomplexan Toxoplasma gondii. These results shed light on HCCU and on the general blue print of the trafficking pathways in malaria parasites.

Die Parasiten der Gattung Plasmodium (Apikomplexa) sind die Krankheitserreger der Malaria und die schwerste Verlaufsform von Malaria wird durch Plasmodium falciparum versuracht. Der Parasit entwickelt sich innerhalb der menschlichen roten Blutzellen bis er diese fast vollständig einnimmt. Während seines Wachstums nimmt der Parasit bis zu 80 % des Wirtszellzytosols auf. Diese Wirtszellzytosolaufnahme („host cell cytosol uptake“, HCCU) dient als Quelle für Aminosäuren und stellt Raum für das Wachstum des Parasiten zur Verfügung. Das aufgenommene Wirtszellzytosol besteht hauptsächlich aus Hämoglobin, welches in die Nahrungsvakuole des Parasiten transportiert und dort proteolytisch verdaut wird. Das dabei entstehende toxische Häm polymerisiert zu einem Hämozoin-Kristall (Malaria-Pigment) und wird in der Nahrungsvakuole eingelagert. Obwohl der Verdauungsprozess des Hämoglobins gut charakterisiert ist, ist bis jetzt kaum bekannt, wie das Wirtszellzytosol in die Nahrungsvakuole gelangt. Bestehende Modelle, basierend auf Inhibitor- und elektronenmikroskopische Studien, vermuten, dass die Wirtszellzytosolaufnahme einen endozytotischen Prozess darstellt. Bis dato liegen jedoch keine Daten vor, die ein Protein diesem Prozess direkt zuschreiben. In vorhergehenden Arbeiten wurden potentielle Endozytose-Faktoren in P. falciparum identifiziert, aber noch kein Beleg für eine Rolle dieser Proteine in der Wirtszellzytosolaufnahme gezeigt. Drei Proteine wurden basierend auf den vorhergehenden Arbeiten für eine detailliertere Untersuchung mit dem Ziel ausgewählt, experimentelle Evidenzen für eine Funktion dieser Proteine in der Wirtszellzytosolaufnahme zu erlangen und somit das erste Mal ein Protein dieses Prozesses zu identifizieren. Die ausgewählten Proteine sind PfClathrin Heavy Chain (CHC), PfEps15 und PfVPS45.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass in dieser Arbeit mit VPS45 das, nach unserem Wissen, erste Protein mit direkter Beteiligung an der Wirtszellzytosolaufnahme gezeigt wurde. Dieses Protein stellt somit einen Anfang für die weitere Charakterisierung der Wirtszellzytosolaufnahme in P. falciparum dar. Die Funktion von Eps15 verbleibt weniger deutlich, aber dieses Protein könnte eine Rolle in frühen Prozessen der Wirtszellzytosolaufnahme übernehmen. Bedeutend ist die hier gezeigte Interaktion von Eps15 und Kelch13, welche möglicherweise einen für die Endozytose regulatorischen Proteinkomplex in P. falciparum bilden. Im Gegensatz dazu hat Clathrin Heavy Chain, ein wichtiges Element der Endozytose in Eukaryonten, keine Funktion in der Endozytose in P. falciparum, sondern scheint eher eine Rolle am Golgi zu übernehmen, was in Übereinstimmung mit der Rolle von Clathrin in dem Toxoplasma gondii (Apicomplexa ) ist. Die Ergebnisse dieser Arbeiten geben Aufschluss über die Wirtszellzytosolaufnahme und vermitteln einen Überblick über die Transport-Prozesse in P. falciparum.