Identification of small molecule inhibitors of clinically relevant human polyomavirus infections

Abstract

While infections with human polyomaviruses are highly prevalent in the healthy population, only four of the 13 so far known human polyomaviruses, MCPyV, TSPyV, JCV and BKV, are associated with severe diseases in immunosuppressed patients. In particular, reactivation of JCV and BKV leads to major complications in transplant patients and other patients receiving immunosuppressive agents. Uncontrolled BKV replication causes two major diseases, hemorrhagic cystitis in 5 – 15% of allogenic transplant patients and polyomavirus associated nephropathy in up to 10% of kidney transplant recipients, resulting in subsequent graft loss. Despite the identification of BKV decades ago, hitherto no specific antiviral drugs are available and treatment of BKV associated diseases is limited to reduction of immunosuppression at the expense of an increased risk of graft rejection. To alleviate the urgent need for novel antiviral therapies, the aim of this study was to identify and subsequently improve novel inhibitors active against BKV infection. Due to limitations concerning efficient in vitro propagation of BKV and highly restricted cell culture systems, the primate polyomavirus SV40 was used as a surrogate virus in a phenotypic high throughput screen of a library comprising approximately 28,000 small molecule compounds, to identify novel inhibitors active against the closely related human polyomaviruses JCV and BKV. In the primary high throughput screen, 33 novel inhibitors active against SV40 infection were identified of which 16 were confirmed in a secondary BKV specific screen in renal proximal tubule epithelial cells. Nine of these inhibitors reduced BKV infection more than 90%. Inhibitors, selected by their in silico predicted physical chemical properties, were tested for broad range activity against JCV and murine polyomavirus infection. While the majority of inhibitors identified as active against BKV show also high inhibitory activity against JCV infection, only four of the 16 compounds inhibit murine polyomavirus infection by 90%. Based on analysis of the chemical structure, five inhibitors of the identified 16 inhibitors were tested for their IC50 and CC50. Four of these compounds demonstrated high inhibitory activity with IC50 values in nanomolar range and a selectivity index of over 10. In particular, one inhibitor, compound C1, exhibited a highly significant inhibitory activity against BKV infection at low concentrations, without inducing host cell toxicity, and displayed a selectivity index of over 100. The inhibitory activity of compound C1 against BKV in renal proximal tubule epithelial cells was extensively investigated for each step during viral life cycle. While the findings in this study indicate that compound C1 blocks entry of BKV infection by interacting either with a viral protein of BKV or a host cell protein regulated upon BKV infection, the precise mechanism that underlies compound C1 induced inhibition of BKV infection requires further analysis in order to identify the cellular or viral target of compound C1. This study presents the identification of 16 small molecule compounds with novel chemical structures that inhibit human polyomavirus infections at low concentrations. Additionally, this study provides strong evidence that compound C1 inhibits BKV entry during infection and identifies compound C1 as a promising candidate for clinical development of drugs against BKV infection.

Humane Polyomaviren sind in der gesunden Bevölkerung weit verbreitet. Die Primärinfektion erfolgt früh im Kindesalter und verläuft klinisch unauffällig im immunkompetenten Wirt. Von den 13 bislang bekannten humanen Polyomaviren können vier, MCPyV, TSPyV, JCV und BKV, unter Immunsuppression zu schweren Erkrankungen führen. Insbesondere die Reaktivierung von JC und BK Virus führt zu erheblichen klinischen Komplikationen in Transplantationspatienten und Patienten, die Immunsuppressiva erhalten. Insbesondere stellt die Anzahl der BKV-Reaktivierungen in nierentransplantierten und knochenmarktransplantierten Patienten ein großes klinisches Problem dar. In 5 – 15% aller Knochenmarktransplantierten kann BKV-Replikation zu einer hämorrhagischen Zystitis beitragen und bis zu 10% aller nierentransplantierten Patienten weisen in Folge der BKV-Reaktivierung eine schwere Nephritis auf, welche ein erhöhtes Risiko einer Abstoßungsreaktion verursacht. Ungeachtet der Entdeckung von BKV vor Jahrzehnten, gibt es bislang keine spezifischen antiviralen Therapien und die Behandlung von BKV-assoziierten Erkrankungen beschränkt sich auf die Reduktion der Immunsuppression, welche jedoch in Organtransplantierten eine Abstoßungsreaktion sowie den Verlust des Spenderorgans auslösen kann. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, neue niedermolekulare Verbindungen zu identifizieren, die effizient und spezifisch BKV-Infektionen inhibieren, und diese hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität zu charakterisieren, um diese in weiteren Verfahren in Richtung präklinische Testung zu optimieren. Da die in vitro Kultivierung von BKV erheblich limitiert ist, wurde das nah-verwandte Affen Polyomavirus SV40 als Surrogat-Virus verwendet, um in einem phänotypischen Hochdurchsatzscreen ca. 28.000 niedermolekularen Verbindungen auf ihre Aktivität gegen SV40 und nahverwandte Polyomaviren zu testen. Im Zuge des primären Hochdurchsatzscreens wurden 33 neue Inhibitoren gegen SV40 identifiziert. In einem BKV-spezifischen sekundären Screen wurden 16 von den insgesamt 33 Inhibitoren in ihrer inhibierenden Aktivität gegen BKV bestätigt. Hierbei inhibierten neun Inhibitoren eine BKV-Infektion in primären renalen proximalen Tubuluszellen um mehr als 90%. Ausgewählte Inhibitoren wurden in Abhängigkeit ihrer in silico abgeschätzten pharmakokinetischen Eigenschaften auf ihre Aktivität gegen eine Infektion mit JCV oder dem Maus-Polyomavirus untersucht. Während die Mehrheit der BKV-Inhibitoren auch eine Infektion mit JCV zu mehr als 90% inhibierten, hemmten im gleichen Maße nur etwa vier der 16 Inhibitoren auch eine Infektion mit Maus Polyomavirus. Basierend auf Analysen der chemischen Struktur wurden fünf der insgesamt 16 Inhibitoren hinsichtlich ihrer IC50- und CC50-Werte in primären Zellen getestet. Dabei wiesen vier dieser Inhibitoren erhebliche BKV-inhibierende Aktivität auf, welche sich in einem IC50-Wert im nanomolaren Bereich und einem Selektivitätsindex über 10 äußerte. Insbesondere ein Inhibitor, bezeichnet als Verbindung C1, hob sich erheblich hervor, da dieser höchst signifikant eine Infektion mit BKV bereits bei einer sehr niedrigen Konzentration hemmte, ohne Zelltoxizität zu verursachen, und einen Selektivitätsindex von über 100 aufwies. Um die BKV-inhibierende Aktivität von Verbindung C1 genauer zu charakterisieren, wurde der Einfluss von C1 auf die einzelnen Schritte des viralen Lebenszyklus im Detail untersucht. Die Ergebnisse in dieser Doktorarbeit deuten darauf hin, dass die Verbindung C1 die ersten Schritte der BKV-Infektion, d.h. den Prozess der Interaktion von BKV mit der Wirtszelle und/oder die Internalisierung beeinträchtigt, indem C1 entweder mit viralen Proteinen von BKV oder mit zellulären Faktoren, die durch BKV reguliert werden, interagiert. Der genaue Wirkmechanismus der Verbindung C1 inklusive der Identifizierung der Zielstruktur muss jedoch in weiteren Studien untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden 16 neue niedermolekulare Verbindungen identifiziert, die hoch signifikant im nanomolaren Bereich eine BKV-Infektion inhibieren. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit erste Versuche durchgeführt, die in ihrer Gesamtheit darauf hindeuten, dass C1 die initialen Schritte der BKV-Infektion hemmt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Verbindung C1 als ein vielversprechender Kandidat für die klinische Weiterentwicklung einer sogenannten pre-lead Struktur identifiziert. In Kollaboration mit industriellen Partnern wird derzeit die Weiterentwicklung vorangetrieben, um präklinischen Testungen dieses neuen BKV/JCV Inhibitors anstoßen zu können.