Titel: Structural and biophysical studies on integral membrane proteins (IMPs) in a native-like lipid environment
Sprache: Englisch
Autor*in: Nitsche, Julius
Schlagwörter: membrane proteins; nanodiscs; PMCAs; structural biology; SAXS/SANS; lipids
Erscheinungsdatum: 2019-08
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-10-25
Zusammenfassung: 
Membrane proteins (IMPs) are embedded into a complex lipid environment. For the majority of biophysical studies it is necessary to extract them from the natural lipid bilayer by solubilisation using detergents. The surrounding detergent micelle, however, is a bad mimic of the lipid bilayer, which often lead to protein instability and reduced activity. Nano-lipoprotein complexes have become a valuable tool for biophysical studies in a native-like lipid environment. These discoidal protein-lipid complexes consist of a lipid bilayer surrounded by an amphipathic protein, yielding a membrane protein incorporated in a lipid environment with a defined size that is soluble in aqueous solution. This carrier systems has been successfully used for functional studies of a variety of different membrane proteins. In the framework of this thesis structural and functional studies on two membrane proteins were carried out using these protein-lipid complexes.
In a first project, a comparitive study of two nano-lipoprotein particles showed that both systems are equally stable and stabilization effects of incorporated membrane proteins are comparable.
In a second project, the activation process of plasma-membrane Ca2+ ATPases (PMCA) was analysed in great detail. PMCAs are key regulators of the Ca2+ homeostasis in eukaryotic cells. They export calcium ions (Ca2+) from the cytosol to the extracellular milieu and are tightly regulated. Calmodulin (CaM), as its main activator, binds to a unique regulatory domain which releases the autoinhibition and activates the pump. In this thesis, the PMCA from A. thalina, ACA8, was characterized. The results revealed that two CaM molecules can bind to the full-length enzyme, which is in good agreement with previous studies on the isolated regulatory domain. Activity assays of ACA8 in nanodiscs further supported the bimodular activation model and showed that negativly charged lipid headgroups are able to stabilize the activated state.
In a third project, the recently developed "stealth carrier" nanodiscs (sND) were applied to membrane proteins for the first time. Fractionally deuterium labelled nanodisc components lead to discs that are effectively invisible to small-angle neutron scattering (SANS), which enables low-resolution structural characterization of membrane proteins in a native-like lipid environment without the contribution of the nanodiscs to the scattering signal. Small-angle neutron scattering data of the bacterial ATP-binding casette (ABC) transporter incorporated into sND revealed a distinct conformational state in the nucleotide free form, which could not be seen in small-angle X-ray scattering experiments. In addition, subtle conformational differences upon nucleotie binding could be detected reliably from the SANS data.
The stealth nanodisc technique was used to characterize the activation process of the plasma-membrane Ca2+ ATPase ACA8. The data revealed large conformational changes and flexible regulatory domain upon CaM binding. A model of the CaM-activated ACA8 could be generated from the SANS data, which, together with the functional data, revealed the structural basis for the activation of PMCAs.

Membranproteine (IMPs) sind von einer komplexen Lipidschicht umgeben. Für die meisten biophysikalischen Studien ist es jedoch notwendig, sie mittels Detergenzien aus der natrlichen Lipiddoppelschicht zu extrahieren. Durch die Verwendung von Detergenzien ist die Proteinstabilität und häufig auch die Aktivität herabgesetzt. Die Entwicklung von Nano-Lipoprotein-Komplexen hat sich für biophysikalische Studien in einer nativen Lipidumgebung als wertvolles Werkzeug herausgestellt. Diese Protein-Lipid-Komplexe bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, die von einem amphipathischen Protein umgeben ist und stabilisiert wird. In diesen Komplexen können Membranproteine eingebaut werden und sind so von einer Lipiddoppelschicht umgeben die eine definierte Größe besitzt und Membranproteine in wässriger Lösung stabilisiert. Diese Technik wurde erfolgreich für funktionelle Studien einer Vielzahl von verschiedenen Membranproteinen eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle und funktionelle Untersuchungen an zwei verschiedenen Membranproteinen mit Hilfe dieser Protein-Lipid-Komplexen durchgeführt.
Im ersten Teil der Arbeit wurden die beiden gängigsten Nano-Lipoprotein Systeme systematisch miteinander verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass beide Systeme gleich stabile Komplexe bilden und in einem ähnlichen Umfang die eingebauten Membranproteine stabilisieren.
In einem zweiten Projekt wurde der Aktivierungsprozess von Plasmamembran Ca2+ -ATPasen (PMCA) detailliert analysiert. PMCAs nehmen eine Schlüsselrolle in der Ca2+-Homöostase in eukaryotischen Zellen ein. Sie transportieren Calciumionen (Ca2+) aus dem Cytosol in das extrazelluläre Milieu. Zudem ist ihre Aktivität streng reguliert. Durch die Bindung von Calmodulin (CaM) an die regulatorische Domäne, wird die Inhibierung durch die regulatorische Domäne aufgelöst und die Pumpe aktiviert. In dieser Arbeit wurde die PMCA aus A. Thalina, ACA8, untersucht und es konnte gezeigt werden, dass zwei CaM-Moleküle and das Volllängenenzym binden, welches ein zuvor postulierten bimodularen Aktivierungsmechanismus bestätigt. Diese Ergebnisse konnten durch Aktivitätsstudien in Nanodiscs weiter untersucht werden und es wurde gezeigt, dass negativ geladene Kopfgruppen der Lipide die Konformation des aktivierten Zustandes stabilisieren und dadurch die Aktivität weiter moduliert wird.
Im dritten Projekt wurden die kürzlich entwickelten "Stealth Carrier" -Nanodiscs (sND) erstmals mit eingebauten Membranproteinen angewendet. Die deuterierten Nanodiscbestandteile bewirken das die Nanodiscs im SANS-Experiment nicht zum Streusignal beitragen. Dies ermöglichte eine niedrigauflösende strukturelle Analyse von Membranproteinen in einer nativen Lipidumgebung, ohne dass die Nanodiscs in die Analyse mit einbezogen werden müssen. SANS-Daten vom bakteriellen ABC Transporter MsbA, welcher in "Stealth Nanodiscs" eingebaut wurde, ergaben einen deutlichen konformationellen Unterschied zu publizierten Kristallstrukturen ohne gebundene Nukleotide. Des Weiteren konnten feine konformationelle Unterschiede durch die Bindung von Nukleotide detektiert werden.
Die "Stealth Carrier" -Nanodiscs (sND) wurden außerdem verwendet um den Aktivierungsprozess der Plasmamembran Ca2+ ATPase ACA8 zu charakterisieren. Die Daten zeigten, dass durch die Bindung von Calmodulin große Konformationsänderungen ausgelöst werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die regulatorische Domäne flexibler wird. Zusammen mit der funktionellen Charakterisierung konnten weitere Informationen über den Aktivierungsmechanismus von PMCAs gewonnen werden.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8619
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-87393
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Tidow, Henning
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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