Entwicklung von Methoden zum Nachweis von Cocos nucifera im Hinblick auf Kokosnussallergien sowie im Kontext der Echtheitsprüfung von Kokosblütenzucker

Abstract

Die Kokospalme gehört zu den wirtschaftlich wichtigsten Palmenspezies der Welt und wird nicht ohne Grund auch als „tree of life“ bezeichnet. Während vor allem in tropischen Regionen schon seit Tausenden von Jahren die Früchte vom Menschen als Lebensmittel, zur Körperpflege und als Heilmittel verwendet werden sowie die Blätter und das Holz als Werkstoff für Dächer, Möbel und auch Musikinstrumente dienen, erfreut sich die exotische Frucht nun auch in westlichen Ländern steigender Beliebtheit. Hier ist vor allem auch der Kokosblütenzucker, über dessen Herstellungs-prozess in Europa noch wenig bekannt ist, zu nennen. Als Alternative zum herkömmlichen raffinierten Haushaltszucker gewinnt er zunehmend an Begehrtheit. Verbunden mit dem steigenden Konsum kokosnusshaltiger Lebensmittel nimmt allerdings auch das Risiko auftretender Kokosnussallergien zu. Um für Betroffene schwerwiegende gesundheitliche Folgen zu vermeiden, ist eine angemessene Kennzeichnung und Überprüfung der Lebensmittel wichtig. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein DNA basiertes Nachweisverfahren für Cocos nucifera zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurden zunächst drei kokosspezifische Primerpaare designt und getestet. Um einen Nachweis mittels real-time PCR zu ermöglichen, wurde, passend zum ausgewählten Primerpaar, eine TaqMan-Sonde entworfen. Das Primer-/Sondensystem wurde sowohl hinsichtlich der Spezifität als auch der Sensitivität geprüft. Dabei zeigten die 27 getesteten Pflanzen- und Tierarten keinerlei Kreuzreaktivität mit dem System. In einer Verdünnungsreihe wurde eine Nachweisgrenze von 1 pg/µL abgeschätzt. Der entwickelte Assay sollte im Anschluss auch dazu genutzt werden, die Echtheit von Kokosblütenzucker zu kontrollieren. Hierfür musste jedoch zunächst eine geeignete Extraktionsmethode ausgewählt werden. Dazu wurden verschiedene Methoden eingehend geprüft und miteinander verglichen. Zur Erhöhung der Präzision waren außerdem Modifikationen des Extraktionsprotokolls nötig. Die benötigte Genauigkeit der Methode konnte jedoch unter Berücksichtigung der Material- und Arbeitskosten nicht erzielt werden. Alternativ wurde ein Metabolomics basierter Ansatz zur Differenzierung verschiedener Zucker getestet. Hierbei wurde festgestellt, dass sich der Herstellungsprozess von Kokosblütenzucker regional unterscheidet. Aufgrund dieses Einflussfaktors erwies sich die hier verwendete Methode als nicht dazu geeignet, Kokosblütenzucker von anderen Zuckern zu unterscheiden. Es folgte schließlich eine Charakterisierung von Kokosblütenzucker, um Rückschlüsse auf den Herstellungsprozess ziehen zu können. Hierfür wurden etablierte Methoden, wie die enzymatische Zuckerbestimmung, 13C/12C-Stabilisotopenanalyse, Glutenbestimmung mittels ELISA, mikroskopische Analysen sowie sensorische Beschreibungen, verwendet. Insgesamt standen der Studie 107 Kokosblütenzuckerproben zur Verfügung. Während in 10 von 59 (= 17 %) getesteten Proben ein signifikanter C4-Zusatz (≥ 10 g/100 g) nachgewiesen werden konnte, enthielten 3 von 36 (= 8 %) Proben Gluten (≥ 20 mg/kg). Bei der Beurteilung der Ergebnisse mussten sowohl verfahrenstechnische Gründe als auch Versuche der Ertragssteigerung durch Streckung berücksichtigt werden. Außerdem mussten stets natürliche Schwankungen des Naturprodukts sowie Unterschiede aufgrund des nicht standardisierten Herstellungsprozesses beachtet werden.

The coconut palm is one of the economically most important palm species in the world and is also called "tree of life". In tropical regions, humans have used the fruits as food, medicine, and cosmetics for thousands of years. Even the leaves and the wood have served as material for roofs, furniture, and musical instruments. Nowadays, the exotic fruit also gains popularity in occidental countries. In this context, coconut blossom sugar should also be mentioned. Not much is known about its manufacturing process in Europe, but it is increasingly gaining popularity as an alternative sweetener to conventionally refined sugar. However, due to the growing consumption of coconut-containing foods, the number of coconut allergies may also increase. To prevent serious health consequences appropriate food labeling and food control is particularly important. The aim of this study was to develop a DNA-based detection method for Cocos nucifera. For this purpose, three sets of coconut-specific primers were designed and tested. To identify coconut by real-time PCR a TaqManTM probe was then developed. Specificity and sensitivity of the primer/probe system were tested. The assay did not show any cross reactivity with 27 other plants and animals. In a dilution series, a limit of detection of 1 pg/µL was determined. The developed assay should also be used to check the authenticity of coconut sugar. Therefore, it was first necessary to select a suitable extraction method. Various methods were tested in detail and compared with each other. In order to increase the precision modifications of the extraction protocol had to be done. However, the required accuracy of the method could not be achieved by taking material and labor costs into account. Alternatively, a metabolomics-based approach was tested to differentiate between various sugars. It was found that the sugar production process differs from region to region. Due to this influencing factor, the method used here proved to be unsuitable for distinguishing coconut blossom sugar from other sugars. Finally, coconut blossom sugar was characterized in order to draw conclusions about the manufacturing process. Established methods such as enzymatic sugar determination, 13C/12C stable isotope analysis, gluten determination using ELISA, microscopic analyses and sensory descriptions were used. A total of 107 coconut blossom sugar samples were available for the study. While a significant C4 addition (≥ 10 g/100 g) was detected in 10 of 59 (= 17 %) tested samples, 3 of 36 (= 8 %) samples contained gluten (≥ 20 mg/kg). When evaluating the results, both technological reasons and attempts to increase the yield by dilution/substitution had to be considered. In addition, fluctuations of the natural product and differences associated with the non-standardized manufacturing process had to be taken into account all the time.