From 2D to 3D - Neurite Guiding Scaffolds for Designer Neuronal Networks

Abstract

In vitro neuronal cultures on artificial substrates are essential tools for neuroscience. Microstructured surfaces and targeted chemical preparation have been utilized in recent years to fabricate substrates for the development of ordered neuronal networks with substrate-specific geometry. In this thesis, new types of culture platforms are introduced that enable the design of tailor-made neuronal networks beyond planar 2D geometries. First, surface shaping to grooves and steps - produced with grayscale lithography, reactive ion etching and nanoimprint lithography - is presented for the study of directed neurite outgrowth on 2.5D pathways. Second, novel 3D cell culture platforms produced with direct laser writing by two-photon polymerization are introduced. These platforms consist of pillars of varying heights with cavities at the top and free-standing tunnels that connect the cavities with each other. Substrates are cultivated with two different kinds of neurons - primary murine cerebellar granular cells and humane midbrain dopaminergic neurons derived from small molecule neural precursor cells. Surface coatings of Al2O3 and the polymer parylene-C promote neuron adhesion and vitality. Topological guidance of neurite outgrowth inherent to the substrate geometry is combined with chemical guidance through selective poly-D-lysine deposition. Simultaneous function of the 3D cell culture platforms as neurocages as well as neuroguides is shown by selective cell adhesion inside the cavities and neurite outgrowth through tunnels, which lead to the formation of ordered neuronal networks. Electrical activity in the neuronal networks is verified and analyzed with patch clamping measurements. Variations of the design of the platforms show that the tunnels can be freely arranged in any spatial direction according to the desired network geometry and act as customizable pathways for neurite outgrowth in 3D. Thus, the presented concept establishes in vitro neuronal networks with design-specific 3D complexity.

Neuronale in vitro Kulturen auf künstlichen Substraten sind wichtige Werkzeuge der Neurowissenschaften. Mikrostrukturierung von Oberflächen und gezielte chemische Behandlung wurden in den vergangenen Jahren angewendet, um Substrate zur Kultivierung von geordneten neuronalen Netzwerken mit substratspezifischer Geometrie herzustellen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit werden neue Arten von Zellkulturplattformen vorgestellt, die die Entwicklung von maßgeschneiderten neuronalen Netzwerken ermöglichen, welche über planare 2D Geometrien hinaus gehen. Zunächst wird Oberflächenmodellierung mit Gräben und Stufen für die Untersuchung von gerichtetem Neuritwachstum mit 2,5D Verlauf gezeigt, die mittels Graustufenlithographie, reaktivem Ionenätzen und Nanoprägelithographie hergestellt wird. Anschließend werden neuartige 3D Zellkulturplattformen vorgestellt, die mittels Laserdirektschreiben durch Zweiphotonenlithographie hergestellt werden. Diese Plattformen bestehen aus Säulen verschiedener Höhe mit Hohlräumen am oberen Ende und freistehenden Tunneln, die diese Hohlräume miteinander verbinden. Die Substrate werden mit zwei verschiedenen Arten von Neuronen kultiviert: Primären Körnerzellen, extrahiert aus Cerebella von Mäusen, und menschlichen dopaminergen Neuronen des Mittelhirns, die aus neuronalen Vorläuferzellen differenziert werden. Al2O3 und das Polymer Parylen-C als Oberflächenbeschichtungen fördern die Adhäsion und Vitalität von Neuronen. Topologische Lenkung von Neuritwachstum durch die Substratgeometrie wird kombiniert mit chemischenm Signalmolekülen durch selektive Abscheidung von Poly-DLysin. Die Effektivität der vorgestellten 3D Zellkulturplattformen sowohl als ’Neuronenkäfige‘ als auch als ’Neuronenguides‘ wird demonstriert durch selektive Zelladhäsion in den Hohlräumen und Neuritewachstum durch die Tunnel. Dies führt zur Ausbildung von geordneten neuronalen Netzen. Elektrische Aktivität der neuronalen Netzwerke wird mittels Patch Clamping nachgewiesen und analysiert. Variationen im Design der Plattformen veranschaulichen, dass die Tunnel je nach gewünschter Netzwerkgeometrie frei im Raum angeordnet werden können und als veränderbare Pfade für Neuritwachstum in 3D fungieren. Damit etabliert das vorgestellte Konzept erfolgreich in vitro neuronale Netzwerke mit designspezifischer 3D Komplexität.