Characterization of a novel interaction between four-and-a-half-LIM domains 2 and cardiomyopathy-associated protein 5 in cardiac myocytes

Abstract

Four-and-a-half-LIM domains 2 (FHL2) ist ein hauptsächlich in Skelettmuskel und Herzmuskel exprimiertes Protein ohne enzymatische Aktivität. FHL2 fungiert unter anderem als Transkriptions-Co-Faktor und verändert sowohl Eigenschaften als auch die Lokalisation verschiedener Proteine durch seine Bindung. Interessanterweise hemmt FHL2 durch eine Interaktion mit extracellular signal-regulated kinase 2 dessen Migration in den Zellkern und übt somit antihypertrophe Effekte in Kardiomyozyten aus. Im Vorfeld zu dieser Arbeit hat unsere Gruppe bereits cardiomyopathy-associated protein 5 (CMYA5) als möglichen Bindungspartner von FHL2 identifiziert. CMYA5 ist ein ebenfalls in Herz- und Skelettmuskelzellen exprimiertes Protein, das die cyclic adenosine monophosphate abhängige protein kinase A bindet und somit dessen intrazelluläre Verteilung steuert. CMYA5, genau wie FHL2, reduziert die Wirkung der pathologischen Calcineurin/Nuclear factor of activated T-cells Signalkaskade. Dies bedeutet, dass CMYA5 eine Rolle in der kardialen Hypertrophieentwicklung spielen könnte. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion zwischen CMYA5 und FHL2 zu verifizieren und daraus resultierende Folgen für deren zelluläre Funktionen in Kardiomyocyten zu untersuchen. Um die Lokalisation der Interaktion innerhalb der Proteine zu identifizieren wurden zunächst acht V5-gekoppelte rekombinante Proteinfragmente von CMYA5 generiert und in in vitro pull-down Experimenten mit Glutathione S-transferase-gekoppeltem FHL2 getestet. Dies zeigte die Bindung von FHL2 sowohl zum C-Terminus, als auch zum N-Terminus von CMYA5. Zusätzlich wurde ein Protein Array durchgeführt, das mehrere 25 Aminosäuren umfassende Peptide dieser Regionen als starke FHL2 Bindungspartner identifizierte. Um die zelluläre Lokalisation zu bestimmen, wurden immunzytochemische Verfahren und konfokale Mikroskopie von Kardiomyozyten aus adulten Ratten durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine Co-Lokalisation beider Proteine nahe der Z-Scheibe kardialer Sarkomere. Diese Ergebnisse wurden mithilfe von Duolink®-Technologie bestätigt. Um die funktionellen Konsequenzen der Interaktion zu untersuchen, wurden neonatale Ventrikelmyozyten von Ratten Phenylephrin ausgesetzt während Peptide die Bindungsstellen für die Proteininteraktion blockierten. Messungen der Zelloberfläche zeigten eine Vergrößerung der mit Peptiden behandelten Zellen und suggerieren somit eine pro-hypertrophe Funktion der Interaktion. Zusammenfassend bestätigen die Daten dieser Dissertation eine funktionell bedeutende Proteinbindung zwischen FHL2 und CMYA5, die weiterer Untersuchungen bedarf.