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Titel: In vitro Reconstitution and Characterization of Soluble Complexes of the Salmonella Type III Secretion System Sorting Platform
Sonstige Titel: In-vitro-Rekonstitution und Charakterisierung von löslichen Komplexen der Sortierplattform des Salmonella Typ-III-Sekretionssystems
Sprache: Englisch
Autor*in: Börnicke, Carl Jonathan
Schlagwörter: protein complex; native mass spectrometry; small-angle X‐ray scattering; Salmonella enterica; Proteinkomplex; Native Massenspektrometrie; Kleinwinkel-Röntgenstreuung; Salmonella enterica
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-05-08
Zusammenfassung: 
During an infection, many pathogenic Gram-negative bacteria manipulate host cells by injecting them with virulence effectors using transmembrane multiprotein complexes such as type III secretion systems (T3SS). These sophisticated nanomachines are complex structures that consist of a basal body embedded in the bacterial envelope and an extracellular needle. This needle inserts into host cell membranes to form a continuous channel for the delivery of proteins into the host cell cytoplasm. The assembly and function of the T3SS are critically dependent on the hierarchical secretion of structural and effector proteins, and it has been proposed that a multi-protein complex attached to the cytosolic side of the T3SS acts as a sorting platform by selecting the appropriate substrates for secretion through the system. However, although this complex plays an essential role in type III secretion, its precise molecular organization and mechanism of function are still incompletely understood.

This work aimed to analyze the Salmonella Typhimurium SPI-1 T3SS sorting platform by in vitro reconstitution and to uncover its molecular architecture and mechanism of assembly in solution. Co-expression of sorting platform components yielded soluble complexes containing the protein SpaO, its shorter isoform SpaOc, the T3SS ATPase InvC and its regulator OrgB. These complexes were analyzed by size-exclusion chromatography and multi-angle light scattering to obtain mass and shape information, and by native mass spectrometry to determine the precise stoichiometry of subunits within each complex. In addition, structural analysis by small-angle X-ray scattering revealed that the largest of the isolated complexes, SpaO/SpaOc/OrgB/InvC, adopts an elongated L-shaped configuration in solution. Together with topology information from tandem mass spectrometry and protein domain pull-down assays, these data could be combined into a model of the architecture of the complex. Importantly, this model is in good agreement with the sorting platform pod densities observed in a previous in situ cryo-electron tomography structure, suggesting that the SpaO/SpaOc/OrgB/InvC complex identified in this study is the soluble core building block from which the complete sorting platform may be assembled. Together, these findings grant insights into the formation and architecture of the T3SS sorting platform, and the purified soluble complexes provide a starting point for in vitro interaction studies between sorting platform complexes and T3SS substrates.

Viele Gram-negative Bakterien manipulieren Wirtszellen während einer Infektion, indem sie ihnen Virulenzeffektoren mit Hilfe von Transmembrankomplexen wie dem Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) injizieren. Diese raffinierten Nanomaschinen sind komplexe Strukturen, die aus einem in die Bakterienmembranen integrierten Basalkörper und einer extrazellulären Nadel bestehen. Diese Nadel durchdringt die Wirtszellenmembran und bildet einen durchgängigen Kanal für den Transport von Proteinen in das Zytoplasma der Wirtszelle. Für die Konstruktion und die Funktion des T3SS ist es zwingend erforderlich, dass Struktur- und Effektorproteine in der richtigen Reihenfolge sekretiert werden und frühere Studien deuten darauf hin, dass ein an die zytosolische Seite des T3SS gebundener Komplex aus mehreren Proteinen als eine „Sortierplattform“ fungiert und die korrekten Substrate für die Sekretion durch das System auswählt. Trotz der essenziellen Rolle dieses Komplexes im Typ-III-Sekretionsprozess sind seine genaue molekulare Organisation und sein Funktionsmechanismus noch immer nicht vollständig erforscht.

Diese Arbeit hatte zum Ziel, die Sortierplattform des Salmonella Typhimurium SPI-1 T3SS in vitro zu rekonstituieren und ihre molekulare Architektur und ihren Aufbaumechanismus zu ergründen. Durch die Koexpression von Sortierplattformkomponenten konnten lösliche Komplexe aus SpaO, seiner kurzen Isoform SpaOc, der T3SS-ATPase InvC und ihrem Regulatorprotein OrgB aufgereinigt werden. Diese Komplexe wurden mit Hilfe von Größenausschlusschromatographie und Mehrwinkel-Lichtstreuung hinsichtlich ihrer Masse und Form untersucht und native Massenspektrometrie wurde genutzt, um die genaue Stöchiometrie der Untereinheiten in den einzelnen Komplexen zu analysieren. Darüber hinaus zeigte die Strukturanalyse mittels Kleinwinkel-Röntgenstreuung, dass der größte der isolierbaren Komplexe, SpaO/SpaOc/OrgB/InvC, eine ausgestreckte L-förmige Konformation besitzt. Tandem-Massenspektrometrie und Pulldown-Experimente mit Proteindomänen lieferten zusätzliche topologische Informationen, wodurch ein Modell der Architektur des Komplexes erstellt werden konnte. Dieses Modell zeigt hohe Übereinstimmung mit den durch Kryoelektronentomographie ermittelten Säulenstrukturen der Sortierplatform, was darauf hindeutet, dass der hier identifizierte SpaO/SpaOc/OrgB/InvC-Komplex den löslichen Baustein darstellt, aus welchem sich die vollständige Sortierplatform zusammensetzt. Zusammengefasst liefern diese Ergebnisse Einsicht in den Aufbauprozess und die Architektur der T3SS-Sortierplatform und die aufgereinigten löslichen Komplexe dienten als Ausgangspunkt für in-vitro-Interaktionsstudien zwischen Sortierplatformkomplexen und T3SS-Substraten.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8680
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-87849
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Kolbe, Michael
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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