Titel: Immunological implications of feto-maternal microchimerism in HLA-haploidentical stem cell transplantation
Sonstige Titel: Immunologische Auswirkungen eines fetomaternalen Mikrochimärismus auf die pädiatrische HLA-haploidente Stammzelltransplantation
Sprache: Englisch
Autor*in: Martin, Lena-Marie
Schlagwörter: microchimerism; stem cell transplantation; NK cells; Mikrochimärismus; Stammzelltransplantation; NK Zellen
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-11-20
Zusammenfassung: 
A persisting fetal microchimerism (FM+) in the maternal peripheral blood is associated with a significantly increased survival of up to 42% of children after haploidentical hematopoietic stem cell transplantation (hHSCT) compared to father-to-child transplantations and transplantations from mothers without detectable fetal cells (FM-). FM means that filial cells are still detectable in the maternal blood system postpartum. These persisting filial cells are termed FM cells. The biological function of FM cells is still controversial. There is a lack of exact quantification and phenotypical characterization, and there are no studies that have identified genetic features that might affect the continued presence of FM cells in some but not all mothers. To more precisely quantify the filial cells, a digital droplet PCR protocol was established. With this protocol, an FM was detected in 37% of all analyzed mothers. Moreover, the FM cells were phenotypically characterized. FM cells had a stem cell-like phenotype marked by expression of CD34+ CD38+/-. Additionally, detection of CD34+ and/or CD133+ suggests the presence of FM cells with a long-term stem cell phenotype. Interactions of killer immunoglobulin-like receptors (KIRs) with their ligands, the human leukocyte antigen (HLA) molecules, have been important for rejection of foreign tissue. In 51 analyzed mother-child pairs, three independent maternal genetic parameters correlated with the persistence of an FM: presence of an HLA-C1 allele, absence of KIR2DL3, and a centromeric KIR B/B motif. When mother and child were HLA-C matched, an FM was favored. In studies analyzing mismatched HSCT, a beneficial effect of KIR-ligand mismatch between donor and recipient had been detected. Therefore, beyond genetic factors, the effect of FM and different KIR phenotype/HLA combinations on the alloreactivity of parental NK cells against filial blasts was analyzed. NK cells from FM+ mothers showed an up to 45% higher activation compared to NK cells from FM- mothers against their children’s leukemic blasts. Particularly, a significantly higher activation of KIR2DS1 and KIR2DS5 expressing NK cells was detected in FM+ mothers compared to FM- mothers after co-culture with their children’s leukemic blasts. These activated cells were potentially educated to recognize and tolerate the filial cells and can therefore distinguish between filial healthy and leukemic cells. However, an effect of an FM on the cytotoxicity of maternal NK cell against filial leukemic blasts was not detected in vitro, suggesting an important role of other immune effector cells, e.g. alloreactive T cells.
A cohort of sibling transplantations was analyzed for the occurrence of a trans-maternal microchimerism (TM). A TM was detected in 62% of the siblings, but occurrence of TM was independent of donor or recipient HLA or KIR and did not affect the outcome.
In the second part of this study, the feasibility to equip human NK92-MI cells and primary NK cells with distinct KIR receptors to modulate their effector function was shown. Single KIR expressing NK92-MI cell lines (NK92-MI-KIR+) were successfully generated with the following KIRs: KIR2DL1, KIR2DS1 and KIR2DS2. Functionality of NK92-MI KIR+ cell lines against single KIR ligand expressing target cell lines or primary leukemic blasts, analyzed by degranulation and cytotoxicity, was not significantly affected by the expressed KIR. This suggest that the cells are potentially inhibited by other (not KIR) receptors expressed on their surface. In addition, NK92-MI cells do not need polarization to exert their effector function, indicating that NK92-MI cells are not a suitable model cell line for functional analysis of KIR receptor insertion. Subsequently, primary NK cells were successfully transduced to express distinct KIRs using alpharetroviral particles that were pseudotyped with RD114/TR. Their functionality was not impaired by the viral challenge, and analysis of their functionality in a small cohort indicated that modification of primary NK cells with distinct KIRs might affect their reactivity, building the basis for further functional analyses of modified primary NK cells. These modified NK cells equipped, with an optimized effector function, could be used to treat patients post-HSCT in cases of viral infections or relapse.

Ein fetaler Mikrochimärismus (FM+) im peripheren Blut von Müttern ist mit einer um bis zu 42% besseren Überlebensrate nach T-Zell-depletierter haploidenter Stammzelltransplantation (hHSCT) von Mutter-zu-Kind assoziiert. Dies wurde im Vergleich zu hHSCTs beobachtet, in denen Kinder Stammzellen von einer Mutter ohne Nachweis von kindlichen Zellen im Peripherblut (FM-) erhalten haben oder aber die Stammzellen von ihrem Vater. Bei einem FM handelt es sich um kindliche Zellen, die noch nach der Geburt in dem Peripherblut von Müttern nachweisbar sind, sogenannte FM Zellen. Die biologische Funktion der FM Zellen ist umstritten. Zudem mangelt es an genauer Quantifizierung und phänotypischer Charakterisierung. Derzeit sind keine Studien bekannt, in denen der Einfluss mütterlicher und/oder kindlicher genetischer Merkmale auf einen FM untersucht wurde.
In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für eine digitale droplet PCR etabliert, welches die genaue Quantifizierung der kindlichen Zellen ermöglicht. In 37% der analysierten Mütter konnte ein FM detektiert werden. Die FM Zellen wiesen einen Stammzell-ähnlichen Phänotypen auf und zeigten sich CD34+ CD38+/-. Zudem konnten CD34+ und/oder CD133+ FM Zellen detektiert werden, was auf langzeitrepopulierenden Stammzellen in dieser Population hindeutet.
Die Interaktion von Killer Zell Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren (KIRs) mit ihren Liganden,
den humanen Leukozyten Antigen (HLA) Molekülen, spielt eine entscheidende Funktion in der Abstoßungsreaktion fremden Gewebes. In 51 untersuchten Mutter/Patienten Paaren korrelierten drei unabhängige mütterliche Merkmale mit der Persistenz eines FM: das Vorhandensein eines HLA-C1 Allels, eines zentromerischen KIR B/B Motives, sowie die Abwesenheit von KIR2DL3. Darüber hinaus wurde ein FM begünstig, wenn Mutter und Kind HLA-ident waren. Studien in HSCT, mit teilweiser HLA Ungleichheit, zeigten, dass eine KIR-Liganden Ungleichheit die Reaktivität von NK Zellen begünstigt. Daher wurde im Folgenden die Wirkung eines FM sowie von KIR Phänotyp/HLA Kombinationen auf die Reaktivität der elterlichen NK
Zellen untersucht. Die NK Zellen von FM+ Müttern zeigten eine um bis zu 45% stärkere Aktivierung nach der Kultivierung mit den leukämischen Blasten ihres Kindes im Vergleich zu NK Zellen von FM- Müttern. Zudem waren signifikant mehr KIR2DS1 und KIR2DS5 exprimierende NK Zellen aktiviert, wenn diese NK Zellen aus FM+ Müttern stammten. Dies lässt vermuten, dass die mütterlichen NK Zellen gelernt haben die kindlichen Zellen zu erkennen und zu tolerieren. Aufgrund dessen könnten sie zwischen gesunden kindlichen und leukämischen Zellen unterscheiden. Ein direkter Einfluss eines FM auf die Zytotoxizität der mütterlichen NK Zellen gegen die kindlichen Blasten konnte nicht gezeigt werden, was vermuten lässt, dass hier andere Effektorzellen eine wichtige Funktion ausüben, z.B. alloreaktive T-Zellen.
Eine Gruppe von Geschwistertransplantationen wurde auf das Vorhandensein eines trans-maternalen Mikrochimärismus (TM) untersucht. Ein TM wurde in 62% der Geschwister detektiert. Weder der HLA- noch der KIR-Genotyp des Spenders oder Empfängers beeinflussten das Auftreten eines TM und es konnte kein Einfluss auf das Überleben der Kinder nach Stammzelltransplantation nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die humane Zelllinie NK92-MI, sowie primäre NK Zellen modifiziert werden können, um bestimmte KIR Rezeptoren zu exprimieren.
Einzel-KIR exprimierende NK92-MI Zelllinien (NK92-MI-KIR+) konnten für die folgenden KIRs erfolgreich hergestellt werden: KIR2DL1, KIR2DS1 und KIR2DS2. Die Funktionalität der NK92-MI-KIR+ Zellen wurde gegen Einzel KIR-Liganden exprimierende Zielzellen oder primäre leukämische Blasten in Form von Degranulation und Zytotoxizität untersucht. Die Funktionalität der NK92-MI-KIR+ Zellen wurde durch die Expression bestimmter KIR Rezeptoren nicht signifikant beeinflusst. Das lässt vermuten, dass die Zellen potentiell durch andere (nicht KIR) Rezeptoren inhibiert werden. Zudem benötigen NK92-MI Zellen keine Polarisierung und Akkumulation verschiedener Signale für die Ausübung ihrer Effektorfunktion, was darauf hindeutet, dass NK92-MI Zellen nicht die ideale Zelllinie sind, um
den Einfluss von KIR Rezeptoren zu untersuchen. Daher wurden im Folgenden humane primäre NK Zellen erfolgreich mit alpharetroviralen Partikeln transduziert, um bestimmte KIRs zu exprimieren. Die viralen Partikel wurden mit RD114/TR pseudotypisiert. Die Behandlung mit den viralen Partikeln hatte keinen Einfluss auf die generelle Funktionalität der NK Zellen.
Funktionelle Analysen in einer kleinen Gruppe deuten darauf hin, dass diese Modifikation die Reaktivität von primären NK Zellen beeinflusst. Das stellt die Basis für weitere funktionelle Analysen von modifizierten NK Zellen dar. Optimierte NK Zellen könnten folglich für eine Behandlung nach Transplantation, z. B. im Falle einer viralen Infektion oder eines Rückfalles, eingesetzt werden.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8731
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-88954
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Müller, Ingo
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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