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Titel: Comparative Proteome Analysis of Breast Cancer Cell Lines: Identification of Biomarkers for Liquid Biopsy Analyses
Sonstige Titel: Komparative Proteomanalyse von Brustkrebs-Zelllinien: Identifizierung von Biomarkern für Flüssigbiopsie Analysen
Sprache: Englisch
Autor*in: Mossahebi Mohammadi, Parinaz
Schlagwörter: liquid biopsy; circulating tumor cell (CTC); biomarker; epithelial to mesenchymal transition (EMT); SILAC
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2020-12-18
Zusammenfassung: 
Breast cancer is the most common cancer among women worldwide. Most of all breast cancers (60 – 80 %) express the estrogen receptor (ER). Patients with this subtype have a good prognosis, as the ER can be used as a target for various therapies. Nevertheless, ER-positive breast cancer is the most common cause of cancer death in women. In most cases, this is caused by metastases, which occur mostly many years after diagnosis (> 5 years).
To form metastases, tumor cells can detach from the primary tumor and reach secondary organs via the blood circulation as so-called circulating tumor cells (CTCs). In order to proliferate in their new microenvironment, the tumor cells must possess certain abilities. The metastatic potential can be mediated by proteins that are expressed by the tumor cells. Such proteins could be used as markers for identification of tumor cells with high metastatic potential. Furthermore, they could be utilized as targets for therapies, which could potentially prevent metastases.
Due to the low frequency of CTCs (about one CTC in 106 - 107 normal blood cells), investigations requiring a high number of cells were not possible until now. With the help of a novel CTC cell line (CTC-ITB-01), which can be used as a model for ER-positive CTCs, for the first time CTCs were available in sufficient numbers for approaches that require a high cell number.
The aim of this work was an in-depth characterization of the CTC-ITB-01 cell line and to compare the proteome of CTC-ITB-01 with the proteome of an ER-positive reference cell line (MCF-7). Since both proteomes were analyzed simultaneously, one of the proteomes had to be labeled. This was achieved using SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) by metabolically labeling a proteome with 13C6-labeled lysine and arginine. The proteins were then identified and quantified by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The mass spectrometric data were subsequently validated by Western blot analysis.
Differentially expressed proteins with a higher expression in the CTC cell line were selected as CTC biomarker candidates. Transmembrane proteins were of particular interest, as such proteins can be used as markers for the detection and enrichment of CTCs. Furthermore, such proteins represent potential targets for therapeutic antibodies. The three transmembrane proteins sushi domain-containing protein 2 (SUSD2), ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1), plexin-A1 and the secreted protein cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61), showed a higher expression in the CTC cell line compared to the reference cell line and were therefore further investigated as follows.
The role of Cyr61 in cell proliferation and metabolic activity of MDA-MB-231 cells was investigated by the BrdU and MTT assay using a Cyr61 knockout model. The knockout of CYR61 in MDA-MB-231 cells resulted in a significantly decreased cell proliferation and metabolic activity. The Cyr61 knockout model was further used for a SILAC co-immunoprecipitation approach, in which thrombospondin-1, a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (ADAMTS1) and interstitial collagenase (MMP1) were identified as potential protein interaction partners of Cyr61. These proteins are involved in the remodeling of the extracellular matrix and could therefore mediate the metastasis-promoting effect of Cyr61.
To use transmembrane proteins as specific CTC biomarkers, they should not be expressed by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). To verify the suitability of the transmembrane proteins SUSD2, ENPP1 and plexin-A1 as CTC biomarkers, the expression of these proteins in PBMCs was analyzed. Western blot analysis revealed that plexin-A1 is expressed by PBMCs, and is therefore not suitable as a specific CTC biomarker. SUSD2 and ENPP1 were not detected in PBMCs, wherefore further investigations were performed for SUSD2 and ENPP1. The expression of Cyr61, ENPP1 and SUSD2 was analyzed on 13 breast cancer cell lines and four prostate cancer cell lines. While Cyr61 and ENPP1 were expressed by breast cancer cell lines with mesenchymal characteristics, the expression of SUSD2 was mainly observed in breast cancer cell lines of the epithelial phenotype. A strikingly high expression of SUSD2 was detected in CTC-ITB-01 and its corresponding mouse xenograft cell line (CTC-ITB-01 MIND), suggesting that this protein could play an important role in the establishment of CTC cell lines. The expression of Cyr61, ENPP1 and SUSD2 was also observed in prostate cancer cell lines.
For the transmembrane proteins ENPP1 and SUSD2 an immunofluorescence staining protocol was established, which can be used in the future for the detection of CTCs in patient samples. Furthermore, a system for magnetic cell separation (MACS®) of SUSD2-positive cells was established, which can potentially be used for the isolation of SUSD2-positive CTCs from the blood of breast cancer patients. For this, evidence for a SUSD2 expression in CTCs of patients was required. Therefore, the CellSearch® system was used to enrich CTCs from the blood of patients with metastatic breast cancer. Subsequently, the enriched CTCs were analyzed for SUSD2 expression by immunofluorescence staining. SUSD2-expressing CTCs were detected in 9 of 23 CTC-positive patients.
In summary, this work provides insights into the biology of ER-positive CTCs and presents three proteins that might play a role in the dissemination of tumor cells. These proteins could also be used as markers for detection or enrichment of CTCs and can be evaluated as potential targets for therapeutic antibodies in further studies.

Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung der Frauen weltweit. In den meisten Fällen (60 – 80 %) handelt es sich dabei um den Östrogenrezeptor-positiven Brustkrebs. Patienten, die diesen Subtyp aufweisen, haben eine gute Prognose, da der Östrogenrezeptor als Angriffspunkt für verschiedene Therapien genutzt werden kann. Trotzdem ist der Östrogenrezeptor-positive Brustkrebs die häufigste krebsbedingte Todesursache der Frauen. In den meisten Fällen wird dies durch Metastasen verursacht, welche häufig erst viele Jahre (> 5 Jahre) nach der Diagnose auftreten.
Um Metastasen zu bilden, können sich Tumorzellen vom Primärtumor lösen und über die Blutzirkulation als sogenannte zirkulierende Tumorzellen (CTCs) an Sekundärorgane gelangen. Um in ihrer neuen Mikroumgebung zu proliferieren, müssen die Tumorzellen über bestimmte Fähigkeiten verfügen. Das metastatische Potential kann dabei von bestimmten Proteinen vermittelt werden, die von den Tumorzellen exprimiert werden. Solche Proteine könnten als Marker verwendet werden, um die Tumorzellen mit hohem metastatischem Potential zu erkennen. Weiterhin könnten sie als Angriffspunkte für Therapien verwendet werden, wodurch die meist tödliche Metastasierung verhindert werden könnte.
Da CTCs mit einer Häufigkeit von etwa einer CTC auf 106 - 107 normalen Blutzellen sehr selten sind, waren Untersuchungen, die eine hohe Anzahl an Zellen erfordern, bisher nicht möglich. Mit Hilfe einer neuartigen CTC-Zelllinie (CTC-ITB-01), welche als ein Model für Östrogenrezeptor-positive CTCs verwendet werden kann, waren erstmals CTCs in ausreichender Anzahl für eingehende Untersuchungen vorhanden.
Ziel dieser Arbeit war es, diese CTC-Zelllinie (CTC-ITB-01) eingehend zu charakterisieren und das Proteom von CTC-ITB-01 mit dem einer Östrogenrezeptor-positiven Referenz-Zelllinie (MCF-7) zu vergleichen. Da beide Proteome simultan analysiert wurden, musste eines der Proteome zur Unterscheidung markiert werden. Dies wurde mittels SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) erzielt, indem ein Proteom mit 13C6-markiertem Lysin und Arginin metabolisch markiert wurde. Anschließend wurden die Proteine mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) identifiziert und quantifiziert. Die massenspektrometrischen Daten wurden im Anschluss mittels Western Blot Analysen validiert.
Differentielle Proteine mit einer höheren Expression in der CTC-Zelllinie wurden als CTC-Biomarkerkandidaten ausgewählt. Dabei waren vor allem Transmembranproteine von Interesse, da solche Proteine als Marker für die Detektion und Anreicherung von CTCs verwendet werden können. Außerdem stellen solche Proteine potenzielle Angriffspunkte für therapeutische Antikörper dar. Die drei Transmembranproteine Sushi domain-containing protein 2 (SUSD2), Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1), Plexin-A1 und das sekretierte Protein Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61) wiesen eine höhere Expression in der CTC-Zelllinie im Vergleich zu der Referenz-Zelllinie auf und wurden daher wie folgt weiter analysiert.
Die Rolle von Cyr61 in der Zellproliferation und der metabolischen Aktivität von MDA-MB-231 Zellen wurde mit dem BrdU- und dem MTT-Test unter Verwendung eines Cyr61 knockout Models untersucht. Die Abschaltung des CYR61 Gens in MDA-MB-231 Zellen führte zu einer signifikant niedrigeren Zellproliferation und metabolischen Aktivität. Das Cyr61 knockout Model wurde weiterhin für eine SILAC Co-Immunpräzipitation eingesetzt, bei der Thrombospondin-1, A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (ADAMTS1) und Interstitial collagenase (MMP1) als potenzielle Protein-Interaktionspartner von Cyr61 ermittelt wurden. Diese Proteine sind an der Remodellierung der extrazellulären Matrix beteiligt und könnten daher den metastasenfördernden Effekt von Cyr61 vermitteln.
Damit Transmembranproteine als spezifische CTC-Biomarker genutzt werden können, sollten sie nicht von den mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) exprimiert werden. Um die Eignung der Transmembranproteine SUSD2, ENPP1 und Plexin-A1 als CTC-Biomarker zu überprüfen, wurden PBMCs auf die Expression dieser Proteine getestet. Mittels Western Blot Analyse konnte gezeigt werden, dass Plexin-A1 von PBMCs exprimiert wird und sich daher nicht als spezifischer CTC Biomarker eignet. SUSD2 und ENPP1 wurden in PBMCs nicht nachgewiesen, weshalb weitere Untersuchungen für SUSD2 und ENPP1 durchgeführt wurden. Die Expression von Cyr61, ENPP1 und SUSD2 wurde auf 13 Brustkrebs- und vier Prostatakrebs-Zelllinien untersucht. Während Cyr61 und ENPP1 insbesondere von Brustkrebs-Zelllinien mit mesenchymalen Eigenschaften exprimiert wurden, konnte die Expression von SUSD2 in Brustkrebs-Zelllinien des epithelialen Phänotyps beobachtet werden. Eine besonders starke Expression von SUSD2 wurde in CTC-ITB-01 und ihrer entsprechenden Xenograft-Mausmodell-Zelllinie (CTC-ITB-01 MIND) nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass dieses Protein bei der Etablierung von CTC-Zelllinien eine bedeutende Rolle spielen könnte. Die Expression von Cyr61, ENPP1 und SUSD2 konnte auch in den Prostatakrebs-Zelllinien beobachtet werden.
Für die Transmembranproteine ENPP1 und SUSD2 wurde jeweils eine Immunfluoreszenzfärbung etabliert, welche in Zukunft zur Detektion von CTCs in Patientenproben genutzt werden kann. Weiterhin wurde ein System zur magnetischen Zellseparation (MACS®) von SUSD2-positiven Zellen etabliert, welches potenziell für die Isolation von SUSD2-positiven CTCs aus dem Blut von Brustkrebspatienten verwendet werden kann. Dazu war zunächst der Nachweis einer SUSD2 Expression auf CTCs von Patienten notwendig. Dafür wurden CTCs aus dem Blut von Patienten mit metastasiertem Brustkrebs mit Hilfe des CellSearch®-Systems angereichert und mittels Immunfluoreszenzfärbung auf eine SUSD2 Expression untersucht. Der Nachweis einer SUSD2 Expression konnte in 9 von 23 CTC-positiven Patienten erbracht werden.
Zusammenfassend bietet diese Arbeit Einblicke in die Biologie von Östrogenrezeptor-positiven CTCs und stellt drei Proteine vor, die eine Rolle in der Disseminierung von Tumorzellen spielen könnten. Diese Proteine können als Marker zur Detektion oder Anreicherung von CTCs genutzt werden und als mögliche Zielstrukturen für therapeutische Antikörpern in weiteren Studien evaluiert werden.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8828
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-90191
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Pantel, Klaus
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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