Titel: Structural and functional insights into apicomplexan gliding and its regulation
Sprache: Englisch
Autor*in: Pazicky, Samuel
Schlagwörter: Plasmodium; Malaria; Structural biology; Toxoplasma; Apicomplexa
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-01-29
Zusammenfassung: 
Apicomplexans are a group of single cell parasitic organisms that are infectious agents of many human and animal diseases. For example, Plasmodium species cause malaria, which infects over 200 million and kills almost 400 thousands people every year. Toxoplasma species have infected about 30-50% of the entire population. While infection is benign for most, it is a threat for immunocompromised patients and pregnant women. Several other apicomplexan species are causative agents of diseases in domesticated animals in Africa, representing further financial and humanitarian burdens.
A typical apicomplexan parasite completes a sophisticated life cycle, usually switching between two host organisms to engage in sexual reproduction in one and the asexual reproduction in the other. During their life cycle, the parasites differentiate into distinct life stages that possess unique shapes and morphologies. Motile life stages, in which the parasites move through the tissues and invade their host cells, are of specific interest because the parasite cells are exposed to the extracellular environment outside the host cells. Consequently, they are more accessible to the host immune system and drugs, making them and their proteins major drug targets.
To move across tissues and invade host cells, apicomplexans use a specific type of motility that does not require a change in their cell shape, called gliding. Many organelles and subcellular structures of the motile apicomplexan stages are designed to mediate efficient gliding and host cell invasion. These parasitic cells are elongated and polarized, forming an apical pole in the anterior and basal end in the posterior of the parasite. The parasites glide and invade the host cell in the apical direction. The apical pole contains specialized secretory organelles, such as micronemes and rhoptries, that discharge important virulence factors essential for gliding and for host cell invasion. Other specialized organelles, alveoli, also called inner membrane complex (IMC), form a network of large flat vesicles underneath the parasite`s plasma membrane to accommodate the molecular motor that powers the motility and invasion process.
This thesis cumulates three separate bodies of work that represent advances in understanding of the processes that are important in gliding motility and host cell invasion by apicomplexan parasites.
The first work (manuscript 1) reveals the structure and the function of the essential light chains (ELCs) of Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii. In apicomplexan parasites, ELCs are part of the glideosome, a larger complex residing between the parasite`s plasma membrane and the IMC. The glideosome consists of a myosin motor protein MyoA, two light chains – ELC and myosin light chain 1 (MLC1) and three glideosome associated proteins (GAPs). It has been shown that ELCs bind the neck domain of MyoA and facilitate an enhanced motor efficiency. However, the molecular mechanism behind this phenomenon remains unclear.
We have shown that the two T. gondii ELCs (TgELC1 and TgELC2) as well as P. falciparum ELC (PfELC) bind a conserved sequence of the MyoA neck domain. We have determined the structures of all ELCs bound in trimeric complexes with their respective MyoA neck domains and MLC1s, representing the first glideosome trimeric complexes shown so far. These structures reveal that the C terminus of PfELC, which is partially unfolded in an unbound state, maintains some degree of flexibility even in the complex, resulting in a different interaction angle compared to TgELCs and explaining lower affinity of PfELC to MyoA compared to its T. gondii analogues. Additionally, we have shed a light on the regulatory function of ELCs, showing that two phosphorylation sites can regulate their binding to MyoA. On the other hand, we proved that the binding of calcium does not regulate the ELC binding and only increases the stability of the trimeric complexes. Finally, we have shown that upon binding, the ELCs induce a formation of secondary structure in MyoA neck, leading to a stiffer MyoA neck that consequently serves more efficiently as a lever arm and increases the motor speed.
In the second project (manuscript 2), we have tackled the role of a rhoptry protein Armadillo Repeat-Only (ARO) and its putative interaction partner, ARO interacting protein (AIP). ARO is anchored to the membrane of the rhoptries from their cytoplasmic side by palmitoylation and myristoylation. In T. gondii, ARO has been shown to be essential for the correct positioning of rhoptries in the apical pole and to interact with AIP1, myosin F (MyoF) and adenylate cyclase beta (ACβ). However, it was not clear whether the same arrangement holds true in P. falciparum.
We solved the crystal structure of PfARO that, with five armadillo repeat motifs, assumes a bean shaped conformation. We identified the P. falciparum homologue of T. gondii AIP1 and showed that AIP1 proteins are only present in apicomplexan organisms, lacking any structural homologues outside of apicomplexan species. Further localisation studies, using super-resolution microscopy, revealed that in P. falciparum, PfARO does not co localise with PfAIP. While PfARO localises to rhoptry bulbs, PfAIP1 is present in rhoptry necks. On the other hand, deletion of the conserved loop of PfARO, that was identified thanks to the solved structure, leads to mis localisation of PfAIP1, suggesting that the two proteins do associate. Finally, proximity-dependent biotin identification approach showed that PfAIP associates with PfACβ and MyoF as in T. gondii, but does not interact with PfARO. Based on these conflicting results, we have proposed two models of PfARO-PfAIP interaction.
The third work (manuscript 3) investigates the structure and function of P. falciparum glycogen synthase kinase (PfGSK3). Human GSK3 regulates diverse processes, such as glycogen metabolism, cell cycle and grow, translation, embryonic development or differentiation of neurons. On the other hand, the role of PfGSK3 is rather elusive. PfGSK3 has been shown to have an impact on parasite`s invasion. During host cell invasion, the parasite forms the moving junction, an interface between the parasitic cell and host cell, through which the parasites glide inside the host cell. The dominant protein forming the moving junction is apical membrane antigen 1 (AMA1) that interacts with rhoptry neck (RON) protein complex on the surface of the red blood cells. AMA1 is a transmembrane protein residing on the surface of Plasmodium species with an N terminal extracellular domain and a short C-terminal cytoplasmic tail. The phosphorylation of this cytoplasmic tail regulates the function of AMA1 and is crucial in the invasion process. The C terminal tail of AMA1 is first phosphorylated by protein kinase A (PKA) and subsequently also by PfGSK3. Consequently, the inhibitors of GSK3 have been shown to impair host cell invasion of the parasite. Although PfGSK3 is an important drug target, its structure and means of regulation are unknown.
In our investigation, we have discovered two factors that regulate the activity of PfGSK3. I have found that PfGSK3 exhibits autophosphorylation, phosphorylating its residues in the activation loop and at the N terminus. We have shown that the N terminus of PfGSK3 is indispensable for its function and that the amount of N terminal phosphorylation positively correlates with PfGSK3 activity. Additionally, we found that bivalent heavy metal ions, such as those of zinc and copper, induce reversible formation of high molecular-weight species of PfGSK3 that are heterogeneous and enzymatically inactive. Thus, our work provide the first insights into processes that possibly regulate the function of PfGSK3 in vivo.

Apicomplexa sind einzellige parasitäre Organismen, die Infektionserreger vieler menschlicher und tierischer Krankheiten sind. Zum Beispiel, die Arten der Plasmodien infizieren jedes Jahr über 200 Millionen und töten fast 400 Tausend Menschen mit Malaria. Toxoplasma Arten infizieren etwa 30 50% der Gesamtbevolkerung und obwohl sie für die meisten Menschen nicht gefährlich sind, stellen sie eine Bedrohung für immungeschwächte Patienten und schwangere Frauen dar. Andere Apicomplexa Arten sind Krankheitserreger bei domestizierten Tieren in Afrika und stellen dadurch eine finanzielle und humanitäre Belastungen dar.
Ein typischer Apicomplexa Parasit weißt einen anspruchsvollen Lebenszyklus auf, typischerweise wechselnd zwischen zwei Wirtsorganismen, um in einem die asexuelle Vermehrung und in dem anderen die sexuelle Reproduktion durchzuführen. Während des Lebenszyklus differenzieren sich die Parasiten in verschiedene Lebensstadien, welche immer eine einzigartige Form und Morphologie besitzen. Motile Lebensstadien, die das Gewebe penetrieren können, sind von besonderem Interesse, da die Parasit Zellen außerhalb der Wirtszellen exponiert sind. Die Parasiten sind folglich für die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts und für Arzneimitteln leichter zugänglich, wodurch die motile Lebensstadien und ihre Proteine wichtige Wirkstoffziele sind.
Um das Gewebe zu penetrieren und in die Wirtszellen einzudringen, verwenden Apicomplexa eine bestimmte Art der Motilität, die keine Änderung ihrer Form erfordert: das Gleiten. Viele Organellen und subzelluläre Strukturen der motilen Apicomplexa Stadien vermitteln ein effizientes Gleiten und Eindringen in die Wirtszellen. Diese Parasiten sind länglich und ihre Zellen sind polarisiert. Durch die Polarität formen sie einen apikalen Pol im vorderen Teil und ein basales Ende im hinteren Teil. Die Parasiten gleiten und dringen in apikaler Richtung in die Wirtszelle ein. Der apikale Pol enthält spezialisierte sekretorische Organellen, wie Mikronemen und Rhoptrien, die wichtige Virulenzfaktoren sekretieren, und für das Gleiten und die Invasion der Wirtszellen wichtig sind. Andere spezielle Organellen, Alveolen (auch als Innerer Membran Komplex, IMC, bezeichnet), bauen ein Netzwerk von großen flachen Vesikel unter der Plasmamembran der Parasiten auf, um den molekularen Motor zu beherbergen, der die Motilität und den Invasionsprozess antreibt.
Diese Arbeit fasst drei Manuskripte zusammen, die Fortschritte beim Verständnis der Prozesse darstellen, die für die Gleitmotilität und die Invasion von Wirtszellen durch Apicomplexa Parasiten wichtig sind.
In der ersten Arbeit (Manuskript 1) wurde die Struktur und Funktion Essentieller Leichtketten (essential light chains, ELCs) von Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii entdeckt. In Apicomplexa sind ELCs ein Teil eines größeren Proteinkomplexes zwischen der Plasmamembran des Parasiten und dem IMC, der als Glideosom bezeichnet wird. Das Glideosom besteht aus einem Myosin Motorprotein MyoA, zwei Leichtketten – ELC und Myosin-Leichkette 1 (MLC1) und drei Glideosom-assoziierten Proteinen (GAPs). Es war bereits bekannt, dass ELCs die Halsdomäne von MyoA binden und dadurch die Motoreffizienz verbessern. Der molekulare Mechanismus hinter diesem Effekt war jedoch unklar.
Wir haben gezeigt, dass die beiden T. gondii ELCs (TgELC1 und TgELC2), sowie auch P. falciparum ELC (PfELC) eine konservierte Sequenz der MyoA-Halsdomäne binden. Wir konnten die Strukturen aller ELCs gebunden in Trimerkomplexen mit den jeweiligen MyoA-Halsdomänen und MLC1s bestimmen. Diese sind die ersten atomoranen Strukturen der Trimerkomplexe des Glideosoms. Die Strukturen zeigen, dass der C Terminus von PfELC, der im ungebundenen Zustand teilweise ungeordnet ist, auch im Komplex ein gewisses Maß an Flexibilität beibehält, was zu einem unterschiedlichen Interaktionswinkel im Vergleich zu TgELCs führt und die geringere Affinität von PfELC zu MyoA im Vergleich zu T. gondii erklärt. Zusätzlich haben wir Aufschluss über die Rolle von ELCs in der Regulation des Glideosoms gegeben. Wir haben gezeigt, dass die Bindung der ELCs zu MyoA durch zwei Phosphorylierungsstellen reguliert werden kann. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass die Bindung von Kalzium die ELC-Bindung nicht reguliert, sondern nur die Stabilität der Trimerkomplexe erhöht. Zuletzt haben wir gezeigt, dass die ELCs bei der Bindung eine Sekundärstruktur im MyoA-Hals induzieren, was zu einem steiferen MyoA-Hals führt, der folglich effizienter als Hebelarm dient und den Motorumsatz erhöht.
In der zweiten Arbeit (Manuskript 2) haben wir uns mit der Rolle eines Rhoptrienproteins Armadillo Repeat-Only (ARO) und mit seinem mutmaßlichen Interaktionspartner ARO Interacting Protein (AIP) befasst. ARO wird auf der zytoplasmatischen Membranseite der Rhoptrien durch Palmitoylierung und Myristoylierung verankert. Für T. gondii wurde schon gezeigt, dass ARO für die korrekte Positionierung von Rhoptrien im apikalen Pol essentiell ist und dass es mit AIP1, Myosin F (MyoF) und Adenylatzyklase Beta (ACβ) interagiert. Wir sind deshalb der Frage nachgegangen, ob ein ähnliches Arrangement auch in P. falciparum existiert.
Dazu haben wir die Kristallstruktur von PfARO gelöst, die mit fünf sogenannten „Armadillo repeat“ Motiven eine bohnenförmige Konformation annimmt. Wir identifizierten das Plasmodium-Homolog von T. gondii AIP1 und zeigten dass die AIP1 Proteine nur in Apicomplexa vorhanden sind und ihre strukturelle Homologen in anderen Taxa fehlen. Weitere Untersuchungen der Proteinlokalisation, auch unter Verwendung von Hochauflösender Mikroskopie, zeigten, dass PfARO in P. falciparum nicht zusammen mit PfAIP lokalisiert ist, da PfARO in Rhoptrien-Bauch lokalisiert ist, während AIP1 in Rhoptrien Hals vorhanden ist. Andererseits führt die Deletion der konservierten Schleife von PfARO, die dank der gelösten Struktur identifiziert wurde, zu einer Fehllokalisierung von PfAIP. Dies deutet darauf hin, dass die beiden Proteine trotz allem assoziieren. Schließlich zeigte der bioID Pulldown-Assay, dass PfAIP, wie auch bei T. gondii, mit PfACβ und MyoF interagiert, jedoch nicht mit PfARO. Basierend auf diesen widersprüchlichen Ergebnissen schlagen wir zwei Modelle der PfARO PfAIP Interaktion vor, die mit unseren Daten übereinstimmen.
In der dritten Arbeit (Manuskript 3) wird die Struktur und Funktion der Glykogensynthase-Kinase 3 von P. falciparum (PfGSK3) untersucht. Humanes GSK3 reguliert verschiedene Prozesse wie den Glykogenstoffwechsel, den Zellzyklus und das Wachstum, die Translation, die Embryonalentwicklung oder die Differenzierung von Neuronen. Andererseits ist die Rolle von PfGSK3 schwer fassbar. Es wurde gezeigt, dass PfGSK3 einen Einfluss auf die Invasion von Parasiten hat. Während des Eindringens in den Wirtszellen bildet der Parasit sogenannte moving junction, eine Grenzfläche zwischen der parasitären Zelle und der Wirtszelle, durch die der Parasit in der Wirtszelle gleitet. Das Protein, das einen Großteil der moving junction bildet, ist das apikale Membranantigen 1 (AMA1), das mit dem Rhoptrien-Hals (RON) auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen interagiert. AMA1 ist ein Transmembranprotein, das sich auf der Oberfläche von Plasmodium-Spezies befindet. Es besitzt eine N-terminale extrazelluläre Domäne und eine kurze C-terminale zytoplasmatische Sequenz. Die Phosphorylierung dieser zytoplasmatischen Sequenz reguliert die Funktion von AMA1 und ist für den Invasionsprozess von entscheidender Bedeutung. Die C-terminale Sequenz von AMA1 wird zuerst durch Proteinkinase A (PKA) und anschließend auch durch PfGSK3 phosphoryliert. Folglich wurde gezeigt, dass die Inhibitoren von GSK3 die Invasion der Wirtszellen durch den Parasiten beeinträchtigen. Obwohl PfGSK3 ein wichtiges Wirkstoffziel ist, sind Struktur und Regulationsmittel unbekannt.
In unserer Untersuchung wurden zwei Faktoren entdeckt, die die Aktivität von PfGSK3 regulieren. Ich habe festgestellt, dass PfGSK3 durch Autophosphorylierung im Protein selbst Aminosäurereste in der sogenannten Aktivierungsschleife und am N-Terminus phosphoryliert. Wir haben gezeigt, dass der N Terminus von PfGSK3 für die Funktion unverzichtbar ist und dass die Menge der N-terminalen Phosphorylierung positiv mit der PfGSK3-Aktivität korreliert. Zusätzlich fanden wir, dass zweiwertige Schwermetalle-Ionen, wie z. B. Zink und Kupfer Ionen, die reversible Bildung von PfGSK3-Spezies mit einem hohen Molekulargewicht induzieren. Diese Spezies sind heterogen und enzymatisch inaktiv. Unsere Arbeit liefert daher erste Einblicke in Prozesse, die möglicherweise die Funktion von PfGSK3 in vivo regulieren.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8829
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-90206
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Löw, Christian
Gilberger, Tim-Wolf
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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