Kinesin-5 in plants – Characterisation of AtKRP125b suggests a new function beyond cell division

Abstract

The sophisticated organisation of cell division requires complex structures of microtubule arrays that are formed and maintained by several microtubule-interacting motor proteins. Among them, members of the kinesin-5 family are one of the most important microtubule-interacting motor proteins. Members of this highly conserved kinesin-5 family are found in almost every eukaryotic organism and play an essential role in the bipolar organisation of the mitotic spindle. These homotetrameric proteins can crosslink microtubules and slide anti-parallel microtubules apart, and thereby guarantee the precise and correct separation of chromatids. Apart from their function in cell division, an increasing number of publications point towards additional functions of kinesin-5s during other stages of cell development, for example the transport of vesicles from the trans-Golgi network to the cell surface or the growth of dendrites and axons. A newly found interaction between one of the four kinesin-5s in Arabidopsis thaliana, AtKRP125b and the E3 ubiquitin ligase SAUL1, which is involved in plant immunity, provides a new prospect for additional functions of kinesin-5s in plants. In this thesis, the biophysical and biochemical motility properties of AtKRP125b were characterised in controlled in vitro motility assays, using a recombinant protein whose necessary quality could only be achieved when produced heterologously in insect cells. The motility assays revealed that AtKRP125b can move along microtubules towards their plus-end with a velocity of about 17 nm s-1 in a processive manner. It was further discovered that AtKRP125b can crosslink microtubules and slide them apart. Additionally, the physiological function of AtKRP125b was investigated. Analysis of the AtKRP125b promoter activity, using promoter-GUS constructs, revealed a main activity in the vascular tissue of roots, leaves and flowers. Interestingly, no promoter activity could be detected in mitotic tissues, such as root- or floral meristems. To investigate whether the loss of AtKRP125b causes a distinct phenotype in tissues with high promoter activity, a T-DNA insertion mutant was examined. However, no consistent differences between the mutant and the wild type could be observed under normal growth conditions nor with applied abiotic stress, thus indicating that a single knockout of one kinesin-5 is not sufficient to cause a distinct phenotype in A thaliana. The generation of additional knockout mutants with the CRISPR/Cas9 technology though did not yield new mutant lines. Finally, the subcellular localisation of AtKRP125b could be determined with GFP-fusion constructs predominantly within the nucleus and cytoplasm. Taken together, these results may suggest that AtKRP125b is able to fulfil the canonical functions of a kinesin-5 regarding the interaction with microtubules. However, the absence of promoter activity in meristematic tissue and the localisation within the cytoplasm during interphase point to additional functions beyond its putative role in cell division.

Die hochpräzise Organisation der Zellteilung erfordert komplexe Strukturen aus Mikrotubuli, die von mehreren mit Mikrotubuli interagierenden Motor-Proteinen gebildet und aufrechterhalten werden. Eine besondere Bedeutung bei diesen Prozessen haben Motor-Proteine der Kinesin-5 Familie, welche in fast jedem eukaryotischen Organismus vorkommen. Diese homotetrameren Proteine spielen eine wesentliche Rolle in der bipolaren Organisation der mitotischen Spindel. Sie sind in der Lage, Mikrotubuli zu vernetzten, und können antiparallel orientierte Mikrotubuli gegeneinander verschieben. Dadurch wird eine korrekte Trennung der Chromatiden während der Mitose gewährleistet. Neben Ihrer Funktion während der Zellteilung werden zusätzliche Funktionen diskutiert, zum Beispiel der Transport von Vesikeln aus dem trans-Golgi Netzwerk zur Zelloberfläche oder das Wachstum von Dendriten und Axonen. Eine neu entdeckte Interaktion zwischen AtKRP125b, einem von vier Kinesin-5 Proteinen in Arabidopsis thaliana, und der E3-Ubiquitin Ligase SAUL1, welche eine Rolle in der pflanzlichen Immunantwort spielt, eröffnet neue Perspektiven für weitere Funktionen von Kinesin-5 in Pflanzen. In dieser Arbeit wurden die biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften von AtKRP125b in verschiedenen in-vitro Experimenten charakterisiert. Das dafür benötigte rekombinante Protein konnte in der erforderlichen Menge und Qualität heterolog in Insektenzellen hergestellt werden. Die in-vitro Experimente zeigten, dass AtKRP125b in der Lage ist, sich prozessiv entlang von Mikrotubuli in Richtung deren Plus-Endes mit einer Geschwindigkeit von etwa 17 nm s-1 zu bewegen. Zudem ist AtKRP125b in der Lage, Mikrotubuli zu vernetzten und in einer bestimmten Orientierung gegeneinander zu verschieben. Des Weiteren wurde die physiologische Funktion von AtKRP125b mit Hilfe einiger in-vivo Experimente untersucht. Die Analyse der Promotoraktivität von AtKRP125b in transgenen Promotor-GUS Pflanzen zeigte eine deutliche Aktivität im vaskulären Gewebe von Wurzeln, Blättern und Blüten. Interessanterweise konnte keine Promotoraktivität in mitotischen Geweben, wie zum Beispiel dem Wurzel- oder Blütenmeristem nachgewiesen werden. Um zu untersuchen, ob der Verlust von AtKRP125b in Geweben mit hoher Promotoraktivität einen abweichenden Phänotyp verursacht, wurde eine T-DNA Insertionsmutante etabliert und untersucht. Es konnten jedoch weder unter normalen Wachstumsbedingungen, noch bei abiotischem Stress konsistente Unterschiede zwischen der Mutante und dem segregierenden Wildtyp festgestellt werden. Dies deutete darauf hin, dass das Ausschalten eines einzelnen Kinesin-5 Gens in Arabidopsis thaliana nicht ausreicht, um einen ausgeprägten Phänotyp zu verursachen. Die Erzeugung zusätzlicher Knockout-Mutanten wurde mittels der CRISPR/Cas9-Technologie angestrebt, es konnten jedoch keine weiteren Mutantenlinien generiert werden. Abschließend konnte die subzelluläre Lokalisation von AtKRP125b während der Interphase durch die konfokale Analyse von GFP-Fusionsproteinen bestimmt werden, welche vorwiegend im Zellkern und im Zytoplasma vorlag. Die im Rahmen dieser Dissertation erzielten Ergebnisse weisen darauf hin, dass AtKRP125b in der Lage ist, die klassischen Funktionen eine Kinesin-5 hinsichtlich der Interaktion mit Mikrotubuli zu erfüllen. Das Fehlen von Promotoraktivität in meristematischem Gewebe, sowie die Lokalisation im Zytoplasma während der Interphase deuten jedoch auf zusätzliche, noch unbekannte Funktionen hin.