Selbstassemblierung und Einkapselung von Edelmetallnanopartikel-Clustern für den Einsatz als biomedizinische SERS-Sonden

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wird eine vierstufige Strategie zur Herstellung von kolloidal stabilen, geschützten und biokompatiblen plasmonischen Nanopartikelclustern (NPC) mit intensiver oberflächenverstärkter Raman-Streuung und hoher intrazellulärer Aufnahme und Stabilität vorgestellt. Dieses Verfahren unterliegt keinen bekannten Einschränkungen hinsichtlich der Größe, Form oder Zusammensetzung der Nanopartikel (NP). Aufgrund des entwickelten skalierbaren und schnellen Phasentransfers mit Polyisopren-diethylentriamin (PI-DETA) können sowohl nativ hydrophile, als auch hydrophobe NP für diese Strategie verwendet werden. Des Weiteren führten Kinetikstudien des Phasentransfers plasmonischer Gold- und Silber-NP zu der Erkenntnis, dass eine Oberflächenbelegung von ca. 3 PI-DETA (1300 g/mol) pro Quadratnanometer für einen effektiven Phasentransfer und langfristig kolloidal stabile Au- und AgNP nötig sind. Über die Variation des Diblockcopolymers Polyisopren-block-Polyethylenoxid (PI-b-PEO) zu PI-DETA-Liganden Verhältnis bei der Mikrofluidik-Einkapselung konnte die Größe der Gold- und Silber-NPC durch die Erhöhung der Anzahl an co-eingekapselten NP in einer Mizelle auf bis zu 200 nm reproduzierbar eingestellt werden. Die durch eine optimierte Saat-Emulsionspolymerisation geformten Polymerhüllen um die NP-Systeme erwiesen sich als wirkungsvoller Schutz gegen Aggregation und Oxidation unter hoher Ionenstärke und extremen Oxidationsbedingungen, wie hohe Cyanid- oder Königswasser-Konzentrationen. Die Biokompatibilitäts-Studien der eingekapselten NP-Systeme zeigten bei der Inkubation mit drei verschiedenen Zelllinien hohe Zellviabilitäten, trotz der sehr hohen zellulären Aufnahme. Weiterhin bestätigten Elektronenmikroskop-Analysen die hohe Zellaufnahme der eingekapselten NP/NPC und die intrazelluläre Stabilität nach der Internalisierung der Strukturen in endosomale Vesikel. Ein Vorteil dieser Einkapselungsstrategie ist, dass das PI-b-PEO vor und nach der Einkapselung der NP mit Antikörpern, Peptiden und anderen Target-Molekülen für eine spezifische Zellaufnahme funktionalisiert werden kann. Die Studien über die Beschichtung der NP mit verschiedenen Raman-aktiven Molekülen (Codierung mit Raman-Reportern (RaR)) ergaben, dass die codierten AuNPC im Vergleich zu den uncodierten AuNPC deutlich stärkere Plasmonenkopplung aufweisen. Die Banden der lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) können über einen großen Spektralbereich von 500 bis 1000 nm durch die Variation der RaR-Inkubationszeit und dem RaR-Codierungsgrad eingestellt werden. Das bedeutet, dass die optischen Eigenschaften der NPC für spektroskopische Anwendungen an die Laseranregungswellenlänge angepasst werden können. Die starke Plasmonenkopplung resultiert aus geringen interpartikulären Abständen der NP in den Clustern, die die Ausbildung von Hotspots des elektrischen Felds bei der LSPR-Anregung verursachen. Die Hotspots führten zu erheblichen Raman-Verstärkungsfaktoren der darin lokalisierten RaR bis in die Größenordnung von zweihunderttausend. Nach aktuellem Stand liegt diese Verstärkung im Grenzbereich der bekannten maximalen analytischen Verstärkungsfaktoren für geclusterte, sphärische AuNP. Insgesamt ist die vorgeschlagene universelle Strategie zur Herstellung von stabilen, biokompatiblen und sensitiven SERS-Plattformen ein signifikanter Schritt vorwärts in Richtung biomedizinischer in vivo-Anwendungen plasmonischer Nanopartikel.

In this work, a four-step strategy for the preparation of colloidally stable, protected and biocompatible plasmonic nanoparticle clusters (NPC) with intensive surface-enhanced Raman scattering and high intracellular uptake and stability is presented. The procedure is not subject to any known restrictions regarding particle size, shape or composition. Due to the developed, scalable and fast phase transfer with polyisoprene diethylenetriamine (PI-DETA), both natively hydrophilic and hydrophobic nanoparticles (NP) can be used for this strategy. Kinetic studies of the phase transfer revealed that the surface coverage of approx. 3 PI-DETA (1300 g/mol) per square nanometer is required to ensure effective phase transfer and long-term colloidal stability of gold- and silver-NP. By varying the polyisoprene-block-polyethylene oxide (PI-b-PEO) to PI-DETA ligand ratio in the microfluidic encapsulation process, the overall size of the gold- and silver-NPC could be tuned up to 200 nm, by increasing the number of co-encapsuleted NP in the formed micelles. The polymer shells formed by an optimized seed emulsion polymerization around the NP systems proved to be effective protection against aggregation and oxidation under high ionic strength and extreme oxidation conditions, such as high cyanide or aqua regia concentrations. The biocompatibility of the encapsulated NP systems was demonstrated by incubation of gold- and silver NP/NPC with three different cell lines. The cells showed high cell viability, despite the very high cellular uptake. Furthermore, electron microscopy analysis of the incubated cells confirmed high cellular uptake and high intracellular stability of the nanostructures, even within the endosomes. An advantage of this encapsulation strategy is that the PI-b-PEO can be functionalized before and after the encapsulation of the NP with antibodies, peptides and other target molecules for specific cellular uptake. The studies on the coating of the NP with different Raman-active molecules (coding with Raman reporters (RaR)) showed that the coded AuNPC have a significantly stronger plasmon coupling compared to the uncoded AuNPC. The bands of the localized surface plasmon resonance (LSPR) can be adjusted over a large spectral range from 500 to 1000 nm by varying the RaR incubation time and the RaR coding level. This implies that the optical properties of the NPC can be adapted to the laser excitation wavelength for spectroscopic applications. The strong plasmon coupling results from small interparticle distances of the NP in the clusters, which cause the formation of hotspots of the electric field during LSPR excitation. The hotspots led to a considerable surface-enhanced Raman scattering (SERS) of RaR located therein. Average analytical enhancement factors up to the order of two hundred thousand were determined. According to the current status, this enhancement is within the known upper limit range of analytical enhancement factors for clustered and spherical AuNP as well as AgNP. Overall, the proposed universal strategy for the production of stable, biocompatible and sensitive SERS platforms is a significant step forward towards biomedical in vivo-applications of plasmonic nanoparticles.