Characterisation of single domain antibodies against the ADP-ribosylating Clostridium difficile toxin CDT and establishment of a murine infection model with the pathogen

Abstract

Das Bakterium Clostridium difficile ist eine Hauptursache von Krankenhaus- und Antibiotika-assoziierten Durchfall. Bei älteren und multimorbiden Patienten werden schwere und sogar tödliche Krankheitsverläufe beobachtet. Die beiden large clostridial toxins (LCTs) Toxin A und Toxin B wurden als wichtige Virulenzfaktoren identifiziert, die durch Glucosylierung kleiner Rho-GTPasen zu einem Zusammenbruch des zelluläre Zytoskelettes führen. Ein drittes binäres Toxin, die C. difficile-Transferase (CDT), wird in hypervirulenten Stämmen wie dem Ribotyp 027 gefunden. Die heptamere CDTb Untereinheit vermittelt die Bindung des Toxins an den Rezeptor der Wirtszelle und die Translokation der enzymatischen CDTa Untereinheit in das Zytosol. Die durch CDTa katalysierte ADP-Ribosylierung von Actin an Arg177 bewirkt ebenfalls eine Disintegration des zellulären Zytoskeletts. Außerdem erhöht es die bakterielle Adhäsion durch Mikrotubuli-basierte Zellprotrusionen und verhindert die Rekrutierung von schützenden eosinophilen Granulozyten. Antikörper gegen Toxin A und B haben bereits Einzug in die Diagnostik und Therapie erhalten. Unsere Arbeitsgruppe hat CDT-spezifische Einzeldomänen-Antikörper (VHHs oder Nanobodies) aus immunisierten Lamas gewonnen. Die einzigartige Struktur von Lama Schwereketten-Antikörpern (hcAbs) ermöglicht die Antigenbindung über eine einzelne variable Immunglobulin Domäne (VHH). Ziele der vorliegenden Arbeit waren die Produktion und Charakterisierung CDTb-spezifischer Nanobodies sowie die Etablierung eines Maus-Modells für Infektionen mit CDT-exprimierenden C. difficile. Hierzu wurden VHHs in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen exprimiert, und hinsichtlich ihrer Spezifität und Affinität für CDTb, sowie einer möglichen Hemmung der Zytotoxizität von CDT analysiert. Die Ergebnisse bestätigen, dasss die VHHs L-19, L-15.3 und die VHHs der Familie L-15.1 CDTb spezifisch binden, mit KD-Affinitäten im niederen und mittleren nanomolaren Bereich. Die VHH L-15.1g hemmt sogar noch im äquimolaren Bereich die durch Behandlung von Zellen mit CDT verursachte ADP-Ribosylierung von Aktin und Disintegration des Zytoskeletts. Zudem wurde in der vorliegenden Arbeit eine Kolonisation von C. difficile im Dickdarm von Mäusen durch eine vorangehende Verabreichung von Antibiotika im Trinkwasser und einer Clindamycin Injektion erreicht. Anzeichen der Erkrankung wurden durch Gewichtsverlust, Histopathologie und erhöhte Verschmutzung des Nestplatzes beobachtet. Das in dieser Arbeit etablierte Maus-Modell kann in Zukunft zur Klärung der Rolle von CDT für die Pathogenität von C. difficile Infektion verwendet werden, die in dieser Arbeit charakterisierten CDTb-spezifischen VHHs könnten in der Diagnostik und/oder Therapie von C. difficile Infektionen Verwendung finden.