Structural and biophysical Analysis of plasmodial and bacterial multimeric Pdx1 - Pdx2 Proteins and Complexes

Abstract

The main pre-requisite of the inhibitor-based selection approaches to cure diseases and infections is based on the evidence that the pathogen drug target must not be present in the host and/or the potential inhibitor must be uncommon in the metabolic pathways of the host to avoid detrimental effects with the host proteins. In ideal cases, new drugs should be developed based on specifically targeting the parasite with minimal or no toxicity to humans. In this context, the essential presence of vitamin B6 biosynthesis enzymes in the metabolic pathways of a majority of pathogenic organisms, and their absence in humans recognized the pyridoxal phosphate (PLP) biosynthesis enzyme complex as a potential drug target. In this context, my thesis research activities were focused on the structure-function-analysis of the PLP synthase complex. The main structural unit and the catalytic center of the PLP synthase complex are constituted by the Pdx1 subunit (PLP synthase domain) forming a dodecamer and Pdx2 (glutaminase domain), which binds independently to Pdx1, establishing a 24meric Pdx1-Pdx2 (Pdx) complex. The essential importance of the PLP synthase complex is based on its structural elements controlling the entry of the substrate to the active site and also the Pdx1-Pdx2 interface regions. Utilizing the PLP synthase enzyme complex as a potential drug target for drug discovery approaches requires information about these important structural elements and/or about the Pdx1-Pdx2 interface regions. The PLP synthase complex enzyme shares its substrates (glutamine, and sugars i.e. ribose 5-phosphate and glyceraldehyde 3-phosphate) with essential host enzymes like glutamine amido-transferase, ribose 5-phosphate isomerase, and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, involved in different metabolic pathways. Therefore, instead of substrate-based inhibitor design targeting the PLP synthase enzymes, Pdx1-Pdx2 interface-based inhibitors, is a wise direction. Considering the potential of PLP synthase enzymes for novel drug development studies, the first part of my thesis is focused on analysing the Plasmodium vivax PLP synthesis proteins (Pdx1, Pdx2, and the Pdx complex) via biophysical characterization and structural investigations. As plasmodial species, protozoan pathogens, are causing severe and fatal malaria diseases and have developed an effective resistance mechanism against most of the currently available antimalarial drugs. This instigates an urgent need to identify new antimalarial drug targets. To characterize the PLP enzymes and their complex in terms of initial drug discovery investigations, the Plasmodium vivax Pdx1, Pdx2, and the Pdx1–Pdx2 (Pdx) complex were investigated by utilizing complementary biophysical and bioanalytical techniques, such as dynamic light scattering (DLS), mass photometry (MP), small-angle X-ray scattering (SAXS), and electron microscopy (EM). In addition, X-ray crystallography structural studies were also carried out for the Pdx1 and Pdx complex applying single-crystal diffraction and utilizing synchrotron radiation at DESY. The biophysical investigations revealed a dodecameric Pdx1 and a monodisperse Pdx complex. However, Pdx2 was identified in monomeric and in different oligomeric states in solution. Interestingly, mixing oligomeric and polydisperse Pdx2 with dodecameric monodisperse Pdx1, investigated by time-resolved DLS and by nanoparticle tracking analysis (NTA), resulted in the gradual disappearance of oligomeric Pdx2 and the formation of a monodisperse Pdx complex with completion in hours. The data revealed the importance of the time-resolved investigation in examining the dynamics of a complex reaction process. Subsequently, the electron microscopy studies revealed the formation of an unsaturated Pdx1-Pdx2 complex with saturation observed with the oligomeric Pdx2. In addition, the crystal structure investigations also revealed a dodecameric PvPdx1, indicating that the dodecameric form of Pdx1 is explicitly a particular feature of plasmodial species. With no doubt, the broad-spectrum antibiotic Penicillin discovery by Alexander Fleming, is one of the utmost achievements in medicine’s history saving countless lives throughout the world over decades. But, the natural resistance development in microbes due to the overuse of the antibiotics, and long-term exposure to these antibiotics result in losing effectiveness very rapidly. Because of the very fast adaptation ability, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) which often appeared in hospital-acquired infections, has become the most life-threatening microbe. With only a few available therapeutic possibilities, its resistance to the currently available antibiotics has been increased. Therefore, concerned institutions and also more than 20 leading biopharmaceutical companies announced the “AMR Action Fund” in July 2020 with an aim of bringing two-four new antibiotics or alternative therapeutics into the market by the year 2030 [1]. Concerning the alarming side effects of antibiotics and issues like multidrug resistance, the novel approach of targeting the metabolic pathways of the microbes, particularly those absent in humans, like vitamin B6 synthesizing Pdx complex enzymes, have gained intent interest as a target for alternative drug design. Pondering the current challenges of drug resistance and other dire effects, the second part of my thesis comprehends the investigation of Staphylococcus aureus Pdx proteins via the aforementioned biophysical techniques and 3D structural studies, for lining up the Pdx proteins as possible alternative targets. Knowing the differences between the eukaryotic and prokaryotic Pdx1 and Pdx2 sequences with thermodynamic and structural differences in their Pdx complexes assembly. Further, the obtained structural insight into the P.vivax Pdx1, and the Pdx complex dynamic oligomerization behavior in solution, S.aureus Pdx proteins were selected with a focus on Pdx1 3D structure and the Pdx complex dynamic studies. SaPdx1, Pdx2, and the Pdx complex were studied by applying complementary bioanalytical techniques, likewise applied in P.vivax Pdx proteins investigations. The data obtained by applying dynamic light scattering (DLS), small-angle X-ray scattering (SAXS), and mass photometry (MP) indicate SaPdx1 in a hexameric state without dodecameric equilibrium form in solution (reported first time in bacteria). SaPdx2 was found stable and in the monomeric solution state, indicated by SEC, DLS and SAXS data. Since S.aureus Pdx1 was showing a hexameric solution state, therefore it was interesting to see whether the hexameric Pdx1 can form complex after mixing with its Pdx2 counterpart. SEC, DLS, and SAXS data indicate the Pdx complex formation with confirmation of the respective protein subunit bands by gel electrophoresis. Whereas, the low-resolution 3D SAXS data shows a tetrameric Pdx complex composed of Pdx1 and Pdx2 in 1:1. Interestingly, contrary to the solution state, SaPdx1 was found in a potential dodecameric form in its 3D structure after investigating its solved crystalline structure. The online interface investigating tool (PISA) which is used for the calculation of the interface score also known as complex formation significance score (CSC), demonstrates a more stable hexamer with less possibility of dodecamer formation for SaPdx1. However, the presence of PO4 ions at the hexamer interface of the protomers is one of the possible reasons for a potential dodecameric crystalline state. In contrast to the P.vivax and other reported Pdx1 crystal structures, complete helices αN and α2´ are appeared and solved in S.aureus Pdx1 crystal structure. The reported data indicate that these helices appeared after Pdx1 binding to Pdx2 proteins and/or R5P bind to Pdx1 with function in Pdx complex stabilization and enzyme catalysis. The helix αN present at the interface of Pdx1-Pdx2 proteins is a potential target region for designing inhibitors by blocking the associated ammonia tunnel involved in the transport of NH3 from the Pdx2 subunit active site to the Pdx1 catalytic center.

Die wichtigste Voraussetzung für die Inhibitor-basierten Selektionsansätze zur Heilung von Krankheiten und Infektionen basiert auf dem Nachweis, dass das Ziel des Erregers nicht im Wirt vorhanden sein darf und/oder der potenzielle Inhibitor in den Stoffwechselwegen des Wirts ungewöhnlich sein muss, um schädliche Auswirkungen auf die Wirtsproteine zu vermeiden. Im Idealfall sollten neue Medikamente entwickelt werden, die speziell gegen den Parasiten wirken und dabei nur minimal oder überhaupt nicht toxisch für den Menschen sind. In diesem Zusammenhang wurde das essentielle Vorhandensein von Vitamin B6-Biosyntheseenzymen in den Stoffwechselwegen einer Mehrheit pathogener Organismen und ihre Abwesenheit beim Menschen den Pyridoxalphosphat-Enzymkomplex (PLP) als potenzielles Wirkstoffziel erkannt. In diesem Zusammenhang konzentrierten sich meine Forschungsaktivitäten auf die Struktur-Funktions-Analyse des PLP-Synthase-Komplexes. Die Hauptstruktureinheit und das katalytische Zentrum des PLP-Synthase-Komplexes bilden die Untereinheit Pdx1 (PLP-Synthase-Domäne), die einen Dodecamer bildet, und Pdx2 (Glutaminase-Domäne), die unabhängig an Pdx1 bindet und einen 24mer Pdx1-Pdx2 (Pdx) Komplex bildet. Die wesentliche Bedeutung des PLP-Synthase-Komplexes beruht auf seinen Strukturelementen, die den Eintritt des Substrats zum aktiven Zentrum steuern, sowie auf den Pdx1-Pdx2-Schnittstellenbereichen. Die Nutzung des PLP-Synthase-Enzymkomplexes als potenzielles Wirkstoffziel für Arzneimittelentdeckungsansätze erfordert Informationen über diese wichtigen Strukturelemente und/oder über die Pdx1-Pdx2-Schnittstellenregionen. Das PLP-Synthase-Komplex-Enzym nutzt die gleichen Substrate (Glutamin und Zucker, d.h. Ribose 5-Phosphat und Glyceraldehyd 3-Phosphat) wie einige essentielle Wirtsenzyme z.B. Glutaminamido-Transferase, Ribose-5-Phosphat-Isomerase und Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind. Daher sind die schnittstellenbasierten Pdx1-Pdx2-Inhibitoren ein besserer Ansatz als das substratbasierte Inhibitordesign, das auf die PLP-Synthase-Enzyme abzielt. Unter Berücksichtigung des Potenzials von PLP-Synthase-Enzymen für neuartige Arzneimittelentwicklungsstudien konzentriert sich der erste Teil meiner Arbeit auf die Analyse der Plasmodium vivax PLP-Syntheseproteine (Pdx1, Pdx2 und der Pdx-Komplex) mittels biophysikalischer Charakterisierung und strukturellen Untersuchungen. Als Plasmodial-Arten verursachen Protozoen-Erreger schwere und tödliche Malariaerkrankungen und haben einen wirksamen Resistenzmechanismus gegen die meisten der derzeit verfügbaren Malariamedikamente entwickelt. Dies führt zu einer dringenden Notwendigkeit, neue Ziele für Malariamedikamente zu identifizieren. Um die PLP-Enzyme und deren Komplex im Hinblick auf erste Arzneimittelentdeckungsuntersuchungen zu charakterisieren, wurden das Plasmodium vivax Pdx1, Pdx2 und der Pdx1-Pdx2 (Pdx) Komplex unter Verwendung komplementärer biophysikalischer und bioanalytischer Techniken wie dynamischer Lichtstreuung (DLS), Massenphotometrie (MP), Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und Elektronenmikroskopie (EM) untersucht. Darüber hinaus wurden für Pdx1 und den Pdx-Komplex auch Strukturstudien mittels Röntgenkristallographie- durchgeführt, bei der Synchrotronstrahlung am DESY für die Beugung an Ein-Kristallen verwendet wurde. Die biophysikalischen Untersuchungen ergaben einen dodecamerischen Pdx1 und einen monodispersen Pdx-Komplex. Pdx2 wurde jedoch in monomeren und in verschiedenen oligomeren Zuständen in Lösung identifiziert. Interessanterweise führte das Mischen von oligomerem und polydispersen Pdx2 mit dodecamerischem monodispersen Pdx1, untersucht durch zeitaufgelöste DLS und nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), zum allmählichen Verschwinden des oligomeren Pdx2 und zur Bildung eines monodispersen Pdx-Komplexes innerhalb von Stunden. Die Daten zeigten, wie wichtig die zeitaufgelöste Untersuchung für die Untersuchung der Dynamik eines komplexen Reaktionsprozesses ist. Anschließend ergaben die Elektronenmikroskopie-Studien die Bildung eines ungesättigten Pdx1-Pdx2-Komplexes, dessen Sättigung mit dem oligomeren Pdx2 beobachtet wurde. Darüber hinaus ergaben die Kristallstrukturuntersuchungen auch eine dodecamerische PvPdx1, was darauf hindeutet, dass die dodecamerische Form von Pdx1 explizit ein besonderes Merkmal von Plasmodien ist. Zweifellos ist die Entdeckung des Breitspektrumantibiotikums Penicillin durch Alexander Fleming eine der größten Errungenschaften in der Geschichte der Medizin, die über Jahrzehnte unzählige Leben auf der ganzen Welt gerettet hat. Aber, die natürliche Resistenzentwicklung in Mikroben aufgrund der übermäßigen Verwendung der Antibiotika, und langfristigen Exposition gegenüber diesen Antibiotika führen zu einem sehr schnellen Verlust der Wirksamkeit. Aufgrund der sehr schnellen Anpassungsfähigkeit ist der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), der häufig bei Krankenhausinfektionen auftritt, zur lebensbedrohlichsten Mikrobe geworden. Mit nur wenigen verfügbaren therapeutischen Möglichkeiten hat sich seine Resistenz gegen die derzeit verfügbaren Antibiotika erhöht. Daher kündigten betroffene Institute und auch mehr als 20 führende biopharmazeutische Unternehmen im Juli 2020 den "AMR Action Fund" mit dem Ziel an, bis zum Jahr 2030 zwei bis vier neue Antibiotika oder alternative Therapeutika auf den Markt zu bringen [1]. In Bezug auf die alarmierenden Nebenwirkungen von Antibiotika und Themen wie Multiresistenzen, werden neuartige Ansätze der Ausrichtung auf die Stoffwechselwege der Mikroben, vor allem diejenigen, die beim Menschen fehlen, wie Vitamin B6 synthetisierende Pdx Komplex-Enzyme, zum Ziel für alternative Arzneimittel-Entwicklungen. Der zweite Teil meiner Abschlussarbeit, der die aktuellen Herausforderungen der Arzneimittelresistenz und anderer negativer Effekte betrachtet, beinhaltet die Untersuchung von Staphylococcus aureus Pdx-Proteinen mit den oben genannten biophysikalischen Techniken und 3D-Strukturstudien, um die Pdx-Proteine als mögliche alternative Ziele zu identifizieren. Dabei wurden die Unterschiede zwischen den eukaryotischen und prokaryotischen Pdx1 und Pdx2-Sequenzen mit thermodynamischen und strukturellen Unterschieden in ihrer Pdx-Komplex-Baugruppe untersucht. Darüber hinaus wurden die erhaltenen strukturellen Einblicke in die P.vivax Pdx1 und das dynamische Oligomerisierungsverhalten des Pdx-Komplexes in Lösung untersucht. S.aureus Pdx Proteine wurden mit einem Fokus auf der Pdx1 3D-Struktur und der dynamischen Studien der Pdx -Komplexe ausgewählt. SaPdx1, Pdx2 und der Pdx-Komplex wurden unter Anwendung komplementärer bioanalytischer Techniken untersucht, die ebenfalls in P.vivax Pdx-Proteinuntersuchungen angewendet wurden. Die durch die Anwendung dynamischer Lichtstreuung (DLS), der Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und der Massenphotometrie (MP) gewonnenen Daten deuten auf SaPdx1 in einem hexamerischen Zustand ohne dodecamerische Gleichgewichtsform in Lösung hin (erstmals bei Bakterien berichtet). SaPdx2 wurde stabil und im monomeren Lösungszustand gefunden, der durch SEC, DLS, und SAXS-Daten verifiziert wird. Da S.aureus Pdx1 einen hexamerischen Lösungszustand zeigte, war es daher interessant zu sehen, ob das hexamerische Pdx1 nach dem Mischen mit seinem Pdx2-Pendant einen Komplex bilden kann. SEC, DLS, und SAXS-Daten zeigen die Pdx-Komplexbildung mit Bestätigung der jeweiligen Protein-Untereinheitsbanden durch Gelelektrophorese. Während die 3D-SAXS-Daten mit niedriger Auflösung einen tetramerischen Pdx-Komplex zeigen, der aus Pdx1 und Pdx2 im Verhältnis 1:1 besteht. Interessanterweise wurde SaPdx1 entgegen dem Zustand in Lösung in der 3D-Struktur in einer potentiellen dodecamerischen Form gefunden, nachdem seine gelöste kristalline Struktur untersucht wurde. Das Online-Schnittstellen-Untersuchungstool (PISA), das für die Berechnung des Schnittstellen-Scores auch als complex formation significance score (CSC) bekannt ist, zeigt ein stabileres Hexamer mit geringerer Möglichkeit der Dodecamerbildung für SaPdx1. Das Vorhandensein von PO4-Ionen an der Hexamer-Schnittstelle der Protomere ist jedoch einer der möglichen Gründe für einen potentiellen dodecamerischen kristallinen Zustand. Im Gegensatz zu den P.vivax und anderen gemeldeten Pdx1-Kristallstrukturen werden die Helices αN and α2´ vollständig in der S.aureus Pdx1-Kristallstruktur angezeigt und gelöst. Die beschriebenen Daten deuten darauf hin, dass diese Helices nach Pdx1-Bindung an Pdx2-Proteine und/oder R5P-Bindung an Pdx1 eine Funktion in der Pdx-Komplexstabilisierung und Enzymkatalyse haben. Die an der Schnittstelle von Pdx1-Pdx2-Proteinen vorhandene Helix αN ist eine potenzielle Zielregion für die Entwicklung von Inhibitoren, indem der zugehörige Ammoniaktunnel blockiert wird, der am Transport von NH3 vom aktiven Zentrum der Pdx2-Untereinheit zum Katalysezentrum Pdx1 beteiligt ist.