Titel: Mass Spectrometry based Proteomic Profiling of Truffles
Sonstige Titel: Massenspektrometrische Proteomanalyse von Trüffeln
Sprache: Englisch
Autor*in: Krösser, Dennis
GND-Schlagwörter: Proteomanalyse; Trüffel; Massenspektrometrie; Flüssigkeitschromatographie; MALDI-MS
Erscheinungsdatum: 2021
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-05-07
Zusammenfassung: 
Trüffel als teures und exklusives Lebensmittel sind ein lohnendes Ziel für Lebensmittelbetrug. Trotz ihres hohen Bekanntheitsgrades standen sie bisher wenig im Fokus der Forschung, insbesondere nicht auf Proteomebene. Ziel dieser Arbeit war es, einen schnellen Profiling-Ansatz zur Identifizierung von Trüffelarten zu entwickeln. Darüber hinaus sollte eine tiefergehende Analyse zur umfassenden Charakterisierung von Trüffelarten durchgeführt werden.
Eine schnelle Identifizierung verschiedener Trüffelarten konnte durch die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeitanalyse (MALDI-TOF) intakter Proteine erfolgreich durchgeführt werden. Dafür wurden Probenvorbereitung und Messungen nach etablierten Protokollen in der Mikrobiologie getestet und auf Trüffel übertragen. Aus den aufgenommenen Spektren konnten eindeutige MALDI-Profile für die verschiedenen Arten erstellt werden, die eine Identifizierung und Differenzierung ermöglichen. Mit dem generierten Datensatz wurden bei einer anschließenden Klassifikationsanalyse bis zu 95 % der Instanzen korrekt klassifiziert.
Nach der schnellen Identifizierung durch die Analyse intakter Proteine erfolgte eine tiefergehende Charakterisierung der Trüffelarten mittels markierungsfreier, differentieller und quantitativer Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) basierter Bottom-up-Proteomik. Verschiedene, etablierte Probenvorbereitungsprotokolle wurden auf ihre Anwendbarkeit für Trüffel getestet. Die Extraktion von Proteinen mit dem ionischen Detergens Natriumdeoxycholat gefolgt von einer tryptischen Proteolyse in Lösung, stellte sich dabei als am besten geeignet heraus. Eine weitere Vereinfachung der Probenvorbereitung war durch die Reduktion der enzymatischen Inkubationszeit sowie die Verwendung eines definierten Extraktionsvolumens-zu-Gewichts-Verhältnisses anstatt eines kolorimetrischen Assays zur Schätzung der Proteinkonzentration möglich.
Durch LC-MS/MS-Messungen von 40 Proben im datenabhängigen Aufnahmemodus (DDA) konnten Trüffelarten bereits differenziert werden. Aus den generierten quantitativen Daten wurden Protein-Fingerabdrücke für T. aestivum, T. melanosporum und T. magnatum erstellt. Obwohl bereits im DDA-Modus eine Differenzierung der Trüffel möglich war, fehlte es an gewünschter Analysetiefe. Daher wurden Messungen im datenunabhängigen Aufnahmemodus (DIA) durchgeführt. Die hierfür erforderliche Spektrenbibliothek wurde mittels zweidimensionaler Chromatographie vor der massenspektrometrischen Analyse generiert. Mit 9,170 Proteinen und 51,628 Peptiden von drei Trüffelarten enthält sie die höchste Anzahl an Trüffelproteinen, die bisher mit Massenspektrometrie identifiziert werden konnte. Durch die Messungen im DIA-Modus wurden 2,715 Proteine mit quantitativen Werten in allen 72 Proben identifiziert. Es wurden wieder Protein-Fingerabdrücke für die verschiedene Trüffelarten erstellt, die nun 2,066 Proteine umfassten. Mit ihnen war eine Differenzierung der Trüffelarten T. aestivum, T. melanosporum, T. magnatum, T. albidum Pico und T. indicum möglich. Die Protein-Fingerabdrücke konnten anschließend auf ein kleineres Panel mit 15 Protein-Markerkandidaten reduziert werden, um eine einfachere Differenzierung der verschiedenen Trüffelarten zu ermöglichen. Nach der globalen Analyse wurden Trüffel durch Spezies-gegen-Spezies-Vergleiche detaillierter miteinander verglichen. Um einen Einblick in die funktionelle Kategorisierung der Proteine mit unterschiedlicher Abundanz zu erhalten, wurde eine Gen-Ontologie-Anreicherungsanalyse durchgeführt. Sowohl im globalen als auch im Spezies-zu-Spezies-Vergleich wurde hierbei eine Anreicherung von Proteinen für verschiedene Stoffwechsel- und Reduktions-Oxidationsprozesse festgestellt. Weiterhin wurde eine Anreicherung von Stoffwechselprozessen für Schwefelverbindungen in T. magnatum und T. melanosporum festgestellt, beides Arten die für ihr starkes Aroma bekannt sind.
Diese Arbeit umfasst somit eine schnelle Methode zur Identifizierung von Trüffelarten auf intakter Proteinebene und eine umfassende proteomische Charakterisierung verschiedener Trüffelarten durch Bottom-up-Proteomik durchgeführt, die eine deutliche Differenzierung der Trüffelarten ermöglichte.

Truffles as expensive food are predestined for food fraud. Although widely known, they are scarcely studied, especially at proteome level. Aim of this thesis was to develop a fast profiling approach for identification of truffle species and to perform a deep profiling approach for comprehensive characterization.
For fast identification, matrix assisted laser desorption-ionization time of flight (MALDI-TOF) analysis of intact proteins was successfully performed on truffle samples. Sample preparation and measurements according to established protocols in microbiology were tested and transferred to truffles. Then 72 samples of different truffle species were prepared and measured. Distinct MALDI profiles for different species could be generated from acquired spectra. An identification and differentiation of species was enabled. Using the generated data set for classification analysis, up to 95 % of instances were classified correctly.
After fast profiling with analysis of intact proteins, in-depth characterization was done by label-free differential quantitative liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) based bottom-up proteomics. Different proteomic sample preparation protocols were tested. Protein extraction by the ionic detergent sodium deoxycholate followed by subsequent tryptic proteolysis in solution was most suitable. Further simplification of sample processing by reducing enzymatic incubation time as well as using a defined extraction volume-to-weight ratio instead of performing a colorimetric assay for estimation of protein concentration was shown to be feasible.
By LC-MS/MS measurements of 40 samples in data-dependent acquisition mode (DDA) truffle species could be differentiated. A protein fingerprint for T. aestivum, T. melanosporum and T. magnatum was created from obtained quantitative data. Although analysis in DDA mode already allowed for differentiation of truffles, it lacked the desired depth in analysis. Therefore, measurements in data-independent acquisition mode (DIA) were performed. A required spectral library was generated by two-dimensional chromatography prior to mass spectrometric analysis. Containing 9,170 proteins and 51,628 peptides of three truffle species, the highest reported number of truffle proteins identified by mass spectrometry to date. Within the DIA measurements, 2,715 proteins were identified with quantitative values over all 78 samples. Protein fingerprints for different truffle species were generated and consisted of 2,066 proteins. Differentiation of samples from truffle species T. aestivum, T. melanosporum, T. magnatum, T. albidum Pico and T. indicum was possible. Obtained quantitative protein fingerprints could be reduced to a smaller protein panel of 15 marker candidates for a simplified differentiation of truffle species. Then truffles were compared in more detail by species-against-species comparisons. For gaining insight into functional categorization of differentially abundant proteins, gene ontology enrichment analysis was performed. In both, global and species-to-species comparison, enrichment was seen for various metabolic and reduction-oxidation processes. Further, enrichment of sulfur-compound metabolic processes was seen for T. magnatum and T. melanosporum, both known for their strong aroma.
In summary, within this thesis a fast method for identification of truffle species on intact protein level was developed and a comprehensive proteomic characterization of different species by bottom-up proteomics was performed and allowed for distinct differentiation of truffle species.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9008
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-92662
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Schlüter, Hartmut
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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