Titel: Characterization of a novel Lin-CD34+CD133+CD41+ HSPC population in Myelofibrosis patients and establishment of a long-term co-culture system
Sonstige Titel: Charakterisierung einer neuartigen Lin-CD34+CD133+CD41+ HSPC Population in Myelofibrose Patienten und Etablierung einer Langzeit-Ko-Kultur
Sprache: Englisch
Autor*in: Köhl, Vera
Schlagwörter: Hämatopoetische Stammzelle; Megakaryopoese; CD41; CD133; Primäre Myelofibrose
GND-Schlagwörter: Hämatologie; Osteomyelofibrose; Stammzelle; Hämatopoese; Zellkultur
Erscheinungsdatum: 2021
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-05-19
Zusammenfassung: 
Die genauen zugrundeliegenden Mechanismen der aberranten Megakaryopoese bei Myelofibrose (MF) sind bisher nur unzureichend verstanden. Als ursächlich diskutiert werden sowohl extrinsische Interaktionen in der Stammzellnische als auch Störungen der intrinsischen Zelldifferenzierung. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Ko-Kultur System mit transgenen humanen Stromazellen, welche entweder THPO oder GM-CSF produzieren, etabliert, mit dem Ziel den Einfluss stark erhöhter Zytokinkonzentrationen innerhalb der Knochenmarksnische auf gesunde und neoplastische hämatopoitische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) zu untersuchen. Hohe Konzentrationen der gewünschten Zytokine konnten erfolgreich nach der Transduktion der Stromazellen nachgewiesen und ihre biologische Aktivität bestätigt werden. Das Ziel diese transgenen Stromazellen zu verwenden um den Langzeiteinfluss der Überexpression lokaler Zytokine auf HSPC zu untersuchen konnte nicht erreicht werden, da diese nicht über die minimal angesetzte Kulturzeit von sechs Wochen stabil geblieben sind.

Im zweiten Teil wurden Veränderungen innerhalb des intrinsischen Differenzierungsprogramms einer neoplastischen HSPC Population von MF Patienten untersucht. Neue Erkentnisse deuteten darauf hin, dass ein Anstieg von präfenziell-megakaryozytischen CD41+ myeloischen Vorläuferzellen ursächlich an der Entstehung von MPN beteiligt sein könnten. Wir konnten eine bisher unentdeckte Lin-CD34+CD133+ (LDP) CD41+ HSPC Population charakterisieren, welche im gesunden Knochenmark eine Präferenz in Richtung der Megakaryopoese aufweist. Insgesamt besitzen LDP CD41+ die Fähigkeit in mehrere Zellreihen zu differenzieren und konnten in vitro Megakaryozyten-Kolonien bilden. Nach Stimulation mit THPO zeigten gesunde LDP CD41+ Zellen eine Differenzierung zu Megakaryozyten und deren Vorläufern. Insgesamt war das proliferative Potenzial dieser Fraktion jedoch geringer als bei LDP CD41-. Letztere waren zudem in der Lage LDP CD41+ Zellen zu generieren. Daraus lässt sich ableiten, dass es sich bei der LDP CD41+ Population um die weniger primitive Differenzierungsstufe handelt. Sowohl in Langzeitkulturen aus LDP CD41+ als auch aus LDP CD41- wurden Langzeit-Koloniebildende Zellen (LTC-IC) gefunden. Jedoch fand sich der Vorläufermarker CD38 in einer Mehrheit von LDP CD41+. Im Vergleich zur vorbeschriebenen CD41+CMP Population verfügen LDP CD41+ weiterhin über das Differenzierungspotenzial für die myeloische Reihe. Eine weitere Aufreinigung der CD41+ Zellen ist notwendig um zu bestätigen, dass CD41+ eine multipotente-langzeit-Stamm- und Vorläuferzelle markiert wie es bereits in der Maus beschrieben wurde.

LDP CD41+ konnten auch im peripheren Blut von MF Patienten nachgewiesen werden, allerdings war der Anteil dieser Zellen innerhalb des CD34+ Kompartiments, im Gegensatz zu einer vorherigen Studie an gesundem Knochemark und dem Knochenmark von ET Patienten, nicht erhöht. Funktionelle Assays konnten belegen, dass LDP CD41+ aus Patienten zwar sowohl die megakaryozytäre als auch die myeloische Reihe bilden konnten, allergings fand sich keine Neigung zur Bildung von Megakaryozyten oder deren Vorläufern. Das Fehlen dieser Präferenz als auch die insgesamt sehr niedrige Frequenz dieser Population unterstützt nicht die Hypothese, dass LDP CD41+ zur aberranten Megakaryopoese im Rahmen der Myelofibrose beitragen.

The exact mechanisms contributing to aberrant megakaryopoiesis in Myelofibrosis (MF) are still unclear but may involve either extrinsic interactions with the niche or disruption of normal differentiation programs. In the first part of this thesis, a co-culture system using transgenic human stromal cells expressing either THPO or GM-CSF was established to monitor the impact of abnormal cytokine production within the BM niche environment on normal and neoplastic HSPC. High levels of the cytokines were detected after transduction, and the biological activity confirmed by functional assays. The aim to use these stroma cells to investigate the long-term effects of local overexpression of the cytokines on hematopoietic stem and progenitor cells was not reached, as the stromal feeder layer did not remain stable over the minimum period of six weeks.

In a second approach, changes in an intrinsic differentiation program were investigated by analysis of neoplastic HSPC in MF patients. A recent report suggested that an increase in megakaryocyte-primed CD41+ myeloid progenitors in MPN patients may contribute to the malignant disease. Here we characterized a novel Lin-CD34+CD133+ (LDP) CD41+ HSPC population primed towards megakaryopoiesis in healthy BM. Overall, LDP CD41+ show multi-lineage potential and formed megakaryocytic colonies in vitro. LDP CD41+ from BM were able to differentiate into megakaryocytes upon stimulation with THPO. However, the proliferative capacity of this fraction was lower than of LDP CD41-, with the latter being able to produce CD41+ progeny. Thus, LDP CD41+ cells lie downstream of the LDP CD41- population in the hematopoietic hierarchy. The presence of long-term colony-initiating cells was observed in both LDP CD41+ and CD41- fractions. The majority of LDP cells expressed the progenitor marker CD38 but are distinct to the unipotent megakaryocyte progenitor CD41+CMP described earlier in that they have maintained myeloid potential. Further purification is necessary to confirm that CD41+ marks a long-term, multipotent HSCP, as has been described in the mouse.

Significantly, LDP CD41+ were also detected in PB from MF patients; however, their levels were not increased within the CD34+ compartment compared to healthy BM, in contrast to a previous study examining BM of ET patients. Functional assays confirmed megakaryocytic and myeloid differentiation capacity, although a pronounced preference for the meg lineage was not observed. The absence of priming towards megakaryopoiesis, as well as the reduction of this fraction in MF patient PB, does not support a contribution to aberrant megakaryopoiesis in Myelofibrosis.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9075
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-93498
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Kröger, Nicolaus
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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