Titel: Study of virological and host chromatin epigenetic modifications occurring in long term HBV infected human hepatocytes
Sprache: Englisch
Autor*in: Pirosu, Andrea
Schlagwörter: HBV; ChIP
GND-Schlagwörter: Hepatitis-B-VirusGND
EpigenetikGND
ChromatinGND
InterferonGND
DNS-MethyltransferaseGND
Erscheinungsdatum: 2021-04
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-09-17
Zusammenfassung: 
Hepatitis B virus (HBV) infection causes chronic hepatitis, liver cirrhosis, and is strongly associated with the development of hepatocellular carcinoma (HCC). Considering that at least 257 million people are chronically infected with HBV worldwide, research on possible therapeutic strategies and on how to eradicate the infection is needed. HBV-mediated epigenetic alterations have been observed in vitro and are commonly found in HBV-related HCCs. In this regard, expression of the regulatory viral protein HBx was shown to promote aberrant DNA hypermethylation in host genes involved in tumor suppression, cell cycle, immune escape, apoptosis and metabolism. Because of the limited availability of HBVinfection models, little is known about the dynamic of epigenetic modifications in the course of infection, whether these are permanently induced, which host genes are mostly targeted and their pathogenic consequences. By employing human liver chimeric mice and taking advantage of the innovative technologies based on next generation sequencing, chronically infected liver specimens were analyzed for HBV-induced changes in host genome methylation. Although the changes were of small entity, differential analysis revealed the presence of at least 38000 differences between HBV infected and uninfected mice, suggesting possible influence of HBV on host methylome. However, this data was not corroborated by DNA methyltransferases expression, which did not change in presence of the virus when compared to controls.
In addition to the methylation study, humanized liver chimeric mice infected with HBV were subjected to chromatin extraction in order to be precipitated with antibodies recognizing the deeply characterized histone post translational modifications (PTMs) H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3. HBV was able indeed to provoke changes on H3K4me3 deposition when compared to controls accumulating at promoters of a cluster of genes in infected mice. ABCG1, CYP26A1, UGT1A1, ZBTB16 and TRABD2B were the strongest hits, showing a tendency to increased expression as well. GRID1 HMGCR, SUMO4, TBC1D14 and MVB12B promoters were enriched for H3K4me3 in the uninfected group. However, the expression levels did not mirror H3K4me3 deposition pattern with the exclusion of HMGCR which appeared downregulated in HBV infected mice. Bioinformatic analysis for H3K27ac revealed fewer differences, some of those were sheared with H3K4me3 deposition while H3K27me3 differences in between groups could not be appreciated.
In line with this study, effects of peg-IFN alpha on cccDNA transcription and its silencing mediated by the SMC5/6 complex were analyzed by treating HBV infected mice for 6 weeks following up for at least additional 6 weeks after ceasing treatment. Peg-IFN alpha treatmentreduces cccDNA intracellular amounts and provokes its silencing by the association of the SMC5/6 complex subunit NSE4. Taking these findings and the scarcity of studies on other type I interferons in the HBV infection context in consideration, peg-IFN beta effects on HBV infection were tested. Although both interferons interact with the same cellular receptor (IFNRA1/IFNRA2), they express different affinity for the receptor resulting in slightly different pathway induction. HBV infected mice received the pegylated cytokine for 6 weeks with another 6 weeks of follow-up with or without HBV entry inhibitor. Indeed peg-IFN could promote a profound reduction in all HBV viral parameters when compared to untreated controls, mirroring peg-IFN alpha effects although in a deeper manner. After 6 weeks, this treatment reduced intracellular cccDNA, together with its silencing (NSE4 cccDNA occupancy), however, it could not be completely excluded that cccDNA loss was due to cell death. Interestingly, HBV parameters did not completely rebound during the follow-up phase if an HBV-entry inhibitor was administered, suggesting that the silencing effects were retained.
To sum up, this doctoral thesis was focused on adapting existing cutting-edge techniques as MeDIP and ChIP to an HBV chimeric model to increase the knowledge on how HBV chronic infection could affect the host epigenetics. Moreover, the effects on viral parameters of peg-IFN alpha and peg-IFN beta were tested, with a focus on SMC5/6 mediated cccDNA silencing.

Die Hepatitis B Virus (HBV) Infektion verursacht eine chronische Hepatitis, Leberzirrhose und sie korreliert stark mit der Entwicklung eines Hepatozelluläres Karzinoms (HCC). Da mindestens 257 Millionen Menschen weltweit mit HBV chronisch infiziert sind, sind neue mögliche therapeutische Strategien nötig, um die Infektion zu eradizieren. Von HBV induzierte epigenetischen Veränderungen wurden in Zellkultur bewiesen und sind oft in HBV verursachten HCCs zu finden. Diesbezüglich wurde das virale, regulatorische HBx-Protein als ursächlich gezeigt, DNA-Hypermethylierung von Wirts-Onkosuppressor-, Zellzyklus-, Immunflucht-, apoptotischen und metabolischen Genen zu fördern. Aufgrund fehlender HBV Infektionsmodelle ist wenig über die Dynamik der epigenetischen Änderungen im Laufe einer HBV Infektion bekannt, insbesondere welche permanent induziert sind und welche Gene am meisten betroffen sind sowie deren pathogene Konsequenzen. Mithilfe humanisierter Mäuse, die den vollen HBV Lebenszyklus unterstützen und der innovativen NGS Technik wurden gezielte HBV induzierte Änderungen an der Wirts DNA Methylierung untersucht.
Obwohl nur kleine Änderungen sichtbar wurden lieferte eine differenzierte Analyse Unterschiede in 38000 Genen zwischen infizierten und uninfizierten Mäusen, was den Einfluss von HBV auf das Wirtsgenom zeigt. Die Expression den DNA-Methyltransferase beider Versuchsgruppen blieb hierbei jedoch unverändert. In einer weiteren Analyse wurde das Chromatin HBV infizierter Mäuse extrahiert mit Hilfe von Antikörpern die post translationalen Modifikationen (PTMs) der Gene H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3 untersucht. Hierbei änderte die HBV Infektion die Anreicherung von H3K4me3 auf Promotoren von Gen Clustern wie ABCG1, CYP26A1, UGT1A1, ZBTB16 und TRABD2B die ebenfalls eine gesteigerte Genexpression zeigten. GRID1 HMGCR, SUMO4, TBC1D14 und MVB12B Promotoren waren für den Marker H3K4me3 angereichert in der uninfizierten Kontrollgruppe. Auf Expressionsebene konnten die Unterschiede bis auf das HMGCR Gen welches in der HBV Gruppe herunterreguliert war nicht bestätigt werden. Bioinformatik Analysen für H3K27ac ergaben weniger Unterschiede, wobei einige Gemeinsamkeiten mit der Anreicherung von H3K4me3 zeigten während H3K27me3 hier keine Unterschiede aufwies.
Im Zusammenhang mit diesen Daten wurden die Effekte einer Beeinflussung durch Peg-IFN alpha auf die cccDNA Expression und deren Herunterregulation durch den SMC5/6 Komplex anhand von Mäusen die zunächst 6 Wochen behandelt wurden und zusätzlich eine Gruppe die anschließend 6 Wochen Rebound ohne Behandlung hatten. Eine Peg-IFN alpha Behandlung reduziert die intrazellul.re cccDNA Menge und induziert deren transkriptionelle Aktivität durch die Verbindung mit der Untereinheit NSE4 des SMC5/6 Komplex. Aufgrund dieser Daten und dem Fehlen weiterer Informationen diesbezüglich über andere Typ 1 Interferone wurde der Effekt von Peg-IFN beta auf eine HBV Infektion untersucht. Obwohl beide Interferone an den gleichen Rezeptor binden (IFNRA1/IFNRA2), besitzen beide unterschiedliche Affinitäten für diesen was zur Induktion verschiedener Signalkaskaden führt.
HBV infizierte Tiere erhielten das pegylierte Zytokin für 6 Wochen und in der Rebound Phase wurde eine Gruppe zusätzlich mit dem Eintrittshemmer Myrcludex B für 6 weitere Wochen behandelt. Peg-IFN beta war in der Lage eine starke HBV Suppression zu induzieren die stärker als die von Peg-IFN alpha ausfiel. Nach 6 Wochen war nicht nur die Menge an cccDNA reduziert, sondern auch deren NSE4 Bindung was zu einer Reduktion der transkriptionellen Aktivität führte. Ob ein Teil der Reduktion durch Zelltod und Einhergehenden Verlust von cccDNA hervorgerufen wurde kann jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden Bemerkenswerter Weise konnte der Unterdrückende Effekt von Peg-IFN beta auch nach Beendigung der Therapie, während der Rebound Phase durch die Gabe eines Eintrittshemmers aufrecht erhalten werden, was einen dauerhaften Supressionseffekt suggeriert.
Zusammenfassend liefert diese Doktorarbeit durch den Einsatz neuster Technologien wie MeDIP und ChIP kombiniert mit dem in vivo HBV uPA Mausmodell neue Erkenntnisse über die Beeinflussung des Wirts und Virusgenoms durch HBV induzierte Änderungen der epigenetischen Faktoren. Mit den neu etablierten Methoden wurden zusätzlich neue Therapieoptionen.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9207
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-95301
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Dandri, Maura
Hoth, Stefan
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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