Titel: Entwicklung neuer Techniken zur Identifizierung und Antagonisierung klonaler Therapieresistenzen bei malignen Gliomen am Beispiel der gezielten Therapie des Serinsyntheseweges
Sonstige Titel: Development of new techniques to identify clonal therapy resistance in malignant gliomas, exemplified by targeted treatment of the serine synthesis pathway
Sprache: Deutsch
Autor*in: Fita, Krystian Daniel
Schlagwörter: Tumorheterogenität; tumor heterogeneity; klonale Therapieresistenzen; intratumorale Heterogenität; Serinsyntheseweg; RGB marking; PHGDH; Gliome; Glioblastome; Hirntumore; Neuroonkologie; Durchflusszytometrie; Analysesoftware; Softwareentwicklung; intratumoral heterogeneity; clonal therapy resistance; serine synthesis pathway; RGB marking; glioblastoma; neuro-oncology; FACS; flow cytometry; FACS analysis software; software development
GND-Schlagwörter: GlioblastomGND
TumorGND
OnkologieGND
TherapieresistenzGND
Fluoreszenzaktivierter ZellsortiererGND
Erscheinungsdatum: 2021
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-09-29
Zusammenfassung: 
Glioblastome sind die häufigsten malignen Hirntumore und sind aufgrund der stark begrenzten Therapiemöglichkeiten derzeit nicht heilbar. Der Serinsyntheseweg und insbesondere die Phosphoglycerat-Dehydrogenase (PHGDH), die den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der de novo-Serinsynthese katalysiert, wurde in den letzten Jahren als potenzielles therapeutisches Target für die gezielte Behandlung einer Vielzahl von Tumorentitäten identifiziert. Aufgrund der begrenzten Serin-Verfügbarkeit im Gehirn wird angenommen, dass die de novo-Serinsynthese auch für das Wachstum von Gliomen von zentraler Bedeutung ist. Da der Serinsyntheseweg außerdem eine wichtige Quelle der zellulären α-Ketoglutarat(αKG)-Versorgung darstellt, wurde insbesondere bei IDH-mutierten (IDHmut) Gliomen aufgrund ihres beeinträchtigten αKG-Metabolismus eine erhöhte Vulnerabilität gegenüber Serinsynthese-Inhibitoren vermutet. Deshalb wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, welche Rolle der Serinsyntheseweg für das Wachstum von IDH-Wildtyp (IDHwt)-Glioblastomen und IDHmut-Gliomen spielt und ob die Blockierung dieses Syntheseweges mittels PHGDH-Inhibition einen möglichen Ansatz zur gezielten Therapie dieser Tumore darstellt. Hierfür wurden anhand von 6 IDHwt-Glioblastomzelllinien und 3 IDHmut-Gliomzelllinien die Auswirkungen der PHGDH-Inhibitoren NCT-503 und CBR-5884 in vitro und in vivo untersucht. In der Tat konnte durch die PHGDH-Inhibition mittels NCT-503 und CBR-5884 bei den untersuchten Gliomzelllinien in vitro eine dosisabhängige Wachstumsinhibition erzielt werden, auf die der IDH1-Status der Zellen jedoch keinen nachweisbaren Einfluss hatte. Allerdings wurden wesentliche Unterschiede in der Wirkweise von NCT-503 und CBR-5884 festgestellt. So konnte keine Korrelation der Wirkung beider Inhibitoren auf das Wachstum unterschiedlicher Gliomzelllinien, sowie auf die Expression von Schlüsselenzymen der zellulären Serinversorgung beobachtet werden. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die Wirkung von CBR-5884, nicht jedoch NCT-503, primär von einer rapiden Induktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) abhängig war. Die beobachteten Effekte ließen insgesamt wesentliche unspezifische Off-Target-Effekte für CBR-5884 vermuten. Die Ergebnisse deuten außerdem darauf hin, dass der Serintransporter SLC1A4 eine Rolle bei der Resistenzbildung gegenüber PHGDH-Inhibitoren spielt und zur Umgehung des Serinsyntheseweges bei Gliomen beiträgt. Weiterhin konnte trotz der vielversprechenden Wirkung von NCT-503 auf Gliomzellen in vitro, selbst bei lokaler Applikation dieses Inhibitors in orthotope Gliom-Xenograft-Tumore keine signifikante Verringerung des Wachstums von Gliomen in vivo erreicht werden.

Das Wachstum von Tumor-Rezidiven ist einer der Hauptgründe für das Scheitern von Krebstherapien bei Gliomen und anderen Tumoren und ist häufig eine Folge der Bildung therapieresistenter Zellklone, was durch eine hohe intratumorale Heterogenität begünstigt wird. Obwohl zur Untersuchung intratumoraler Heterogenität unter anderem das RGB-Marking als Multilabelingtechnik zur Verfügung steht, fehlte es bislang an effizienten Verfahren, um die klonale Vielfalt markierter Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie zu visualisieren und zu quantifizieren, sowie einzelne Zellklone präzise zu verfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb eine FACS-Analysesoftware namens „ChromoClone“ entwickelt, die mittels speziell hierfür entwickelter Analyseverfahren und Metriken eine effiziente und präzise durchflusszytometrische Untersuchung der klonalen Vielfalt sowie einzelner Zellklone in RGB-markierten Zellpopulationen ermöglicht. Dabei wurde nicht nur die Visualisierung durchflusszytometrischer Daten mittels sphärischem Scatterplotting implementiert, die eine effiziente visuelle Einschätzung der klonalen Farbvielfalt RGB-markierter Zellpopulationen ermöglicht, sondern auch die Chromatizitäts-Metrik χ vorgestellt, die eine Quantifizierung dieser visuellen Einschätzung erlaubt. So konnte anhand der Analyse orthotoper Xenograft-Gliome aus RGB-markierten Gliomzellen mit der ChromoClone Software visuell und quantitativ nachgewiesen werden, dass die Zelllinien BT112, BS153 und U87 während des Tumorwachstums in vivo ein unterschiedliches Maß an klonaler Restriktion erfahren. Diese Methode kam zudem in einer Studie zur Rolle des Immunsystems bei der klonalen Restriktion von Gliomen zum Einsatz, in der unter Verwendung der ChromoClone Software gezeigt werden konnte, dass GL261-Mausgliome während des in vivo-Wachstums in immunkompetenten Mäusen eine signifikant höhere klonale Restriktion durchlaufen als in immunsupprimierten Mäusen.

Weiterhin wurde mittels dieser Software eine Methodik etabliert, die eine präzise Isolierung einzelner Zellklone aus RGB-markierten Zell-Mischpopulationen per FACS ermöglicht. Hierdurch konnten, nach der wiederholten Behandlung RGB-markierter Gliomzelllinien mit NCT-503 oder CBR-5884, einzelne Gliomzellklone isoliert werden, die signifikante Therapieresistenzen gegenüber diesen Inhibitoren aufwiesen. Im Zuge dessen wurde außerdem auch ein Gliomzellklon mit signifikant verringerter NCT-503- und CBR-5884-Resistenz extrahiert. Die Analyse resistenter Zellklone deutete darauf hin, dass Resistenzen gegenüber sowohl NCT-503 als auch CBR-5884 durch die Erhöhung der Expression von SLC1A4 oder PHGDH vermittelt werden könnten. Abschließend konnte ein außerdem ein Verfahren etabliert werden, welches durch die simultane Analyse mehrerer Zellklone im selben Ansatz ein effizientes Screening einzelner Zellklone im Hochdurchsatzverfahren ermöglicht.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass PHGDH ein potenzielles Target zur gezielten Therapie von Gliomen darstellt, dass jedoch der Serintransporter SLC1A4 eine Rolle bei der Bildung von Resistenzen gegenüber einer solchen Therapie spielen könnte. Weiterhin wurden in dieser Arbeit wichtige Grundlagen zur Untersuchung intratumoraler Heterogenität und klonaler Therapieresistenzen mittels RGB-Marking geschaffen, indem Techniken etabliert wurden, die eine effiziente Identifizierung und Isolierung therapieresistenter Zellklone ermöglichen. Gleichzeitig wurde mit ChromoClone eine umfangreiche FACS-Analysesoftware entwickelt, die in Zukunft auch anderen Forschungsgruppen den Zugang zu den vorgestellten Verfahren ermöglichen kann. Die Fähigkeit zur weitergehenden Analyse therapieresistenter Zellklone ermöglicht zudem die Testung von Strategien zur Antagonisierung solcher Resistenzen.

Glioblastoma is the most common malignant brain tumor and is currently incurable. The serine synthesis pathway and in particular phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH), which catalyzes the first and rate-limiting step of de novo-serine synthesis, has been identified in recent years as a therapeutic target for treatment of various cancer types. Due to limited serine availability in the brain, de novo serine synthesis is also thought to be important for glioma growth. The serine synthesis pathway is also a major source of cellular α-Ketoglutarate (αKG) production. Since IDH-mutated (IDHmut) gliomas are known to have an impaired αKG metabolism, IDHmut gliomas in particular were suspected to show increased vulnerability to inhibition of serine synthesis.

Therefore, this thesis investigated the role of the serine synthesis pathway in growth of IDH wild-type (IDHwt) glioblastomas and IDHmut gliomas and analyzed the potential of de novo serine synthesis blockage by PHGDH inhibition as a targeted therapy approach for of these tumors. To this end, 6 IDHwt glioblastoma cell lines and 3 IDHmut glioma cell lines were used to study the effects of the PHGDH inhibitors NCT-503 and CBR-5884 in vitro and in vivo. PHGDH inhibition by NCT-503 and CBR-5884 in vitro reduced proliferation of glioma cells in a dose-dependent manner, however IDH1 status had no detectable influence on this effect. Notably, NCT-503 and CBR-5884 had different effects on glioma cells, as no correlation between these inhibitors in terms of growth inhibition on different glioma cell lines, as well as expression of key enzymes of cellular serine supply could be observed. In addition, growth inhibition by CBR-5884, but not NCT-503, was shown to be primarily dependent on rapid and strong induction of reactive oxygen species (ROS). The effects observed in this study indicated substantial nonspecific off-target effects for CBR-5884. The results also suggested that the serine transporter SLC1A4 played an essential role in the development of resistance to PHGDH inhibitors and contributed to bypassing the serine synthesis pathway in gliomas. Despite the promising effect of NCT-503 on glioma cells in vitro, however, local application of this inhibitor into orthotopic glioma xenograft tumors failed to significantly reduce glioma growth in vivo.

Tumor recurrence is a major cause for failure of cancer therapies in gliomas and other tumors and is often caused by the formation of therapy-resistant tumor cell clones, which in turn is enhanced by high intratumoral heterogeneity. Although RGB(Red-Green-Blue)-marking, among other multilabeling techniques, is available for studying intratumoral heterogeneity, efficient methods to visualize and quantify the clonal diversity of RGB-labeled cell populations by flow cytometry and to precisely track individual clones were not available. Therefore, a FACS analysis software called "ChromoClone" was developed, which uses specially developed analysis procedures and metrics to enable efficient and precise flow cytometric analysis of clonal diversity as well as individual cell clones in RGB-labeled cell populations. The visualization of flow cytometry data by spherical scatter plotting facilitated efficient visual assessment of the clonal color diversity of RGB-labeled cell populations. Also, the chromaticity metric χ was introduced, which allowed quantification of this visual assessment. Thus, analysis of orthotopic xenograft gliomas derived from RGB-labeled glioma cells using the ChromoClone software provided visual and quantitative evidence that BT112, BS153, and U87 glioma cells experience different levels of clonal restriction during tumor growth in vivo. This method was also used in a study investigating the role of the immune system on clonal restriction in glioblastoma, which revealed that GL261 mouse glioblastomas undergo significantly higher levels of clonal restriction in immunocompetent compared to immunosuppressed mice during in vivo growth.

Furthermore, using this software, a method was established that facilitates the precise isolation of single clones from RGB-labeled mixed cell populations by FACS. Thus, after repeated treatment of RGB-labeled glioma cell lines with NCT-503 or CBR-5884, single glioma cell clones were isolated from bulk cell populations that showed significant resistance to these inhibitors. Additionally, a glioma cell clone with significantly reduced NCT-503 and CBR-5884 resistance could also be extracted. Analysis of resistant cell clones suggested that resistance to both NCT-503 and CBR-5884 was mediated by increase of SLC1A4 or PHGDH expression. Finally, an additional method was established, which allows efficient screening of individual cell clones by simultaneous analysis of multiple cell clones in the same population.

In conclusion, the results indicate that PHGDH is a potential target for targeted therapy in glioma but also suggest that the serine transporter SLC1A4 may contribute to the development of resistance to such therapy. Furthermore, this thesis provides a basis for the investigation of intratumoral heterogeneity and clonal resistance to therapy using RGB marking by establishing techniques that allow efficient identification and isolation of treatment-resistant clones. Additionally, ChromoClone, a comprehensive flow cytometry analysis software, was developed that may allow other researchers to access these techniques in the future. The ability to further analyze treatment-resistant cell clones also enables testing of strategies to antagonize such resistances.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9242
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-95747
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Lamszus, Katrin
Kehr, Julia
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

Dateien zu dieser Ressource:
Datei Beschreibung GrößeFormat  
Dissertation Krystian Fita 2021.pdf22.35 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen
Zur Langanzeige

Info

Seitenansichten

67
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 06.12.2021

Download(s)

33
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 06.12.2021
Werkzeuge

Google ScholarTM

Prüfe