Titel: Analyses of function and tissue-specific expression of the Na,K-ATPase β-subunits and associated α1-subunits in Oncopeltus fasciatus
Sprache: Englisch
Autor*in: Herbertz, Marlena
Schlagwörter: Septate Junctions; cardenolid-adapted; final ecdysis; protein abundance; tissue-specific expression
GND-Schlagwörter: Natrium-Kalium-PumpeGND
CoevolutionGND
HerzglykosideGND
InsektenGND
Erscheinungsdatum: 2021-07
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-09-30
Zusammenfassung: 
The evolutionary arms race between plants and their herbivores has driven the diversification of secondary plant compounds and the counter strategies developed by herbivores. The synthesis of cardiac glycosides (CGs) requires specific adaptation of the herbivores to use and to feed on the CG-containing plants, yet other non-adapted herbivores are repelled by the CGs. CGs bind to the α-subunit of the vital, in all animal cells expressed Na,K-ATPase (NKA). Binding of the toxic compounds blocks the ion channel and leads to a disruption of the enzymatic cycle resulting in detrimental physiological alterations with severe health effects for the non-adapted herbivores. Several animals evolved target-site insensitivity by substitutions in the highly conserved CG binding pocket located on the α-subunit of the NKA.
Some of the CG-adapted insects evolved multiple copies of the α-subunit through gene duplications. Four α1-paralogs exist in the large milkweed bug Oncopeltus fasciatus that differ in number and identity of resistance conferring substitutions. The paralogs trade-off CG resistance against enzymatic activity. Furthermore, four β-subunits exist that modulate the NKAs behavior. To date, only little is known about the adaptive value of such a subunit diversity as found in O. fasciatus. Especially, the functional roles of the β-subunits are mostly unknown, although evidence indicates that their function is not limited to chaperon the α-subunits or modulate the NKAs properties. Because we still scratch the surface of the tissuespecific and pump-independent functions of the NKA in insects, characterizing the enzymatic properties and functions of the different α and β-paralogs and their combinations is crucial to our understanding of the role of the NKA in whole-organism physiology. In this thesis, I characterized nine different in cell culture expressed NKA complexes of O. fasciatus and investigated their resistance against two structurally different CGs: the host plant specific cardenolide calotropin and ouabain, which is normally not taken up by O. fasciatus. Remarkably, calotropin had a higher inhibitory potency on the NKA complexes than ouabain. This effect was most prominent in the least resistant αC complexes. Furthermore, the NKA complex αCβ3 showed a significantly higher enzyme activity compared to the other complexes, suggesting a modulatory effect of β3 on the enzyme. Moreover, differences in sensitivity between previously constructed α1-mimics based on the Drosophila enzyme and the original O. fasciatus α1-paralogs strongly point to the importance of additional substitutions that might modulate the effect of resistance conferring substitutions or mitigate their pleiotropic effects. Ensuing analyses of α1/β-composition in the nervous tissue of O. fasciatus supported the predominance of the highly active but less resistant αCβ3 complex, but in addition, the highly resistant but less active αB as well as β2 were abundant in this tissue pointing to the existence of various NKA complexes adjusted to cell and tissue-specific needs. Furthermore, I investigated the distribution and function of the four β-subunits by implementing RT-qPCR, IHC and RNAi experiments. All four β-subunits showed cell and tissue-specific distribution. The mRNA expression levels of β1 were highest in almost all tissues (except for nervous tissue), yet this was not necessarily reflected on the protein level. The suppression of β2 showed the most pervasive tissue specific effects, which might be related to its possible role in septate junction formation. As a most striking effect, however, knockdown of β1, β2, and β3 resulted in severe molting problems during the final ecdysis, which might also be related to disrupted septate junction formation. Moreover, my data suggests the existence of β-homomeric and NKA higher order complexes. These findings along with the effects caused by specific β knockdowns predict further, yet unknown pump-independent functions to fulfill tissue-specific requirements.

Das evolutionäre Wettrüsten zwischen Pflanzen und ihren Herbivoren hat die Diversifizierung von sekundären Pflanzenstoffen und die Entwicklung von Gegenstrategien der Herbivoren vorangetrieben. Die Synthese von Herzglykosiden erfordert spezifische Anpassungen der Herbivoren, um die Herzglykosid-haltigen Pflanzen fressen und nutzen zu können, während andere, nicht-adaptierte Pflanzenfresser von den Herzglykosiden abgeschreckt werden. Herzglykoside binden an die α-Untereinheit der lebenswichtigen, in allen tierischen Zellen exprimierten Na,K-ATPase (NKA). Das Binden der Giftstoffe resultiert in einer Blockade des Ionenkanals der NKA, welches zu einer Unterbrechung des enzymatischen Kreislaufes führt. Zur Folge kommt es zu schädlichen physiologischen Veränderungen mit schwerwiegenden gesundheitlichen Auswirkungen auf die nicht-angepassten Herbivoren. Einige Tiere evolvierten einen Herzglykosid-unempfindlichen Zielort vermittelt durch Aminosäure-Substitutionen in der sonst hochkonservierten Herzglykosid-Bindetasche der NKA α-Untereinheit. Einige der Herzglykosid-adaptierten Insekten evolvierten mehrere α-Untereinheitskopien durch Genduplikationen. In der großen Milchkrautwanze Oncopeltus fasciatus existieren vier α1-Paraloge, die sich in Anzahl und Identität der Resistenzvermittelnden Aminosäure Substitutionen unterscheiden. Diese Paraloge unterscheiden sich in ihrer Herzglykosid-Resistenz und Enzymaktivität. Des Weiteren existieren vier β-Untereinheiten, die das Verhalten der NKA modulieren. Bis heute weiß man nur wenig über den adaptiven Wert solch einer Untereinheitsvielfalt, wie sie in O. fasciatus zu finden ist. Insbesondere sind die funktionalen Aufgaben der β-Untereinheiten weitgehend unbekannt, obwohl vieles darauf hindeutet, dass sie nicht nur Chaperon- und NKA-modulierende Funktionen besitzen. Da wir noch am Anfang der Erforschung gewebespezifischer und pumpenunanbhängiger Funktionen der Insekten-NKA stehen, ist die Charakterisierung der
enzymatischen Eigenschaften und Funktionen der verschiedenen α- und β- Paralogen und deren Kombinationen entscheidend für unser Verständnis der physiologischen Bedeutung der NKA im Gesamtorganismus. In dieser Doktorarbeit charakterisierte ich neun unterschiedliche, in Zellkultur exprimierte, NKA-Komplexe von O. fasciatus und untersuchte deren Resistenzen gegen zwei sich strukturell unterscheidende Herzglykoside: das wirtspflanzenspezifische Cardenolid Calotropin und Ouabain, welches normalerweise nicht von O. fasciatus aufgenommen wird. Bemerkenswerterweise hatte Calotropin eine stärker hemmende
Wirkung auf die NKA-Komplexe als Ouabain. Dieser Effekt war am stärksten in den am wenigsten resistenten αC-Komplexen. Darüber hinaus zeigte der NKA-Komplex αCβ3 eine signifikant höhere Enzymaktivität im Vergleich zu anderen NKA-Komplexen, was auf eine modulatorische Wirkung von β3 auf das Enzym hindeutet. Außerdem wurden Sensitivitätsunterschiede gegen Herzglykoside zwischen vorausgegangenen Imitationen basierend auf der Drosophila-NKA und den hier untersuchten, echten O. fasciatus NKA α1-Kopien festgestellt. Diese Unterschiede weisen auf die Bedeutung zusätzlicher Aminosäure-Substitutionen in den echten α1-Untereinheiten hin, die entweder eine modulierende
Wirkung auf Resistenz-vermittelnde Aminosäure-Substitutionen haben oder deren pleiotrope Wirkungen abmildern können.
Anschließende Untersuchungen der α1/β-Zusammensetzungen im Nervengewebe von O. fasciatus unterstützten die vorherrschende Existenz des hochaktiven, aber weniger resistenten αCβ3-Komplexes, außerdem wurden hohe Abundanzen der resistenten, aber wenig aktiven αB-Untereinheit und β2 festgestellt. Diese Ergebnisse deuten auf die Formierung unterschiedliche NKA-Komplexe hin, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften gewebespezifische Bedürfnisse erfüllen können. Schließlich untersuchte ich mit Hilfe von RT-qPCR, IHC und RNAi-Experimenten die Verteilung und die Funktionen der vier β-Untereinheiten. Alle vier β-Untereinheiten zeigten eine zell- und gewebespezifische Verteilung. Das β1-Gentranskript war in allen Geweben am höchsten exprimiert (mit Ausnahme des Nervengewebes). Die hohe Expression spiegelte sich allerdings nicht unbedingt auf Proteinebene wider. Der Knockdown von β2 zeigte die meisten gewebespezifischen Effekte, welche mit einer möglichen Rolle von β2 bei der Bildung von Septate Junctions zusammenhängen können. Der auffälligste Effekt konnte allerdings nach dem Knockdown von β1, β2 und β3 beobachtet werden, hier kam es zu schwerwiegenden Häutungsproblemen während der finalen Ekdyse, die möglicherweise auf eine durch den Knockdown verursachte Störung der Septate Junctions-Bildung hindeuten. Des Weiteren deuten meine Daten auf die Existenz von β-Homomeren und NKA-Komplexen höherer Ordnung hin. Diese Befunde, zusammen mit den festgestellten Auswirkungen spezifischer β knockdowns, sagen weitere, noch unbekannte pumpenunabhängige Funktionen voraus, die der Erfüllung gewebespezifischer Anforderungen dienen.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9274
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-96154
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Dobler, Susanne
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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