Optimierung und Charakterisierung einer TALE-Nuklease zur Herstellung HIV-resistenter T-Zellen für die klinische Anwendung

Abstract

Bei einer HIV-Infektion handelt es sich um eine behandelbare, aber chronische Erkrankung, die in der Regel eine lebenslange Therapie mit antiretroviralen Medikamenten erfordert. Das Auftreten von Resistenzen, Medikamentenwechselwirkungen und Komorbiditäten machen alternative Ansätze zur Behandlung von HIV-positiven Patienten dennoch notwendig. Aus Beobachtungen ist bekannt, dass ein Fehlen des HIV-Korezeptors CCR5 (C-C Chemokinrezeptor 5) auf humanen Zellen zu einer Resistenz gegenüber den häufigsten HIV-Stämmen führt. Der CCR5-Knockout in autologen Zellen gilt in der Gentherapie als wichtiger Ansatz bei der Entwicklung alternativer Therapiestrategien für HIV-positive Patienten. Das Ziel der vorliegenden Dissertation bestand in der Optimierung der zuvor entwickelten Designernuklease CCR5-Uco-TALEN. Die optimierte TALEN sollte darüber hinaus mit dem Ziel der Translation in die klinische Anwendung umfassend charakterisiert werden. Zudem sollte ein GMP-kompatibles Protokoll zur Herstellung CCR5-editierter CD4+-T-Zellen entwickelt werden. Die Untersuchungen im ersten Teil dieser Dissertation zur CCR5-Uco-TALEN Aktivität in humanen T-Zellen, bestätigten eine dosisabhängige Geneditierung am On-Target CCR5 und am Off-Target CCR2. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die CCR5-Uco-TALEN Aktivität in den meisten editierten Zellen (72 %) zu einer biallelischen Geneditierung im CCR5-Lokus führt. Die Analyse weiterer Off-Targets der CCR5-Uco-TALEN identifizierte mehrheitlich homodimere TALEN-Paare als Ursache für die CCR5-Uco-TALEN Aktivität an jenen Loci. Um diese Off-Targets zu eliminieren, wurde die bisher verwendete homodimere Fok1-Schneidedomäne in der CCR5-Uco-TALEN gegen eine obligat heterodimere Variante ausgetauscht. Die neue CCR5-Uco-hetTALEN erlaubt ebenfalls eine sehr effiziente Editierung des CCR5-Lokus und gleichzeitig eine höhere Spezifität, da außer CCR2 keine weiteren Off-Targets detektiert wurden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die optimierte CCR5-Uco-hetTALEN in Hinblick auf ihre klinische Anwendung charakterisiert. Untersuchungen zur Kinetik am CCR5- und CCR2-Lokus wiesen auf eine Aktivität der CCR5-Uco-hetTALEN nur innerhalb der ersten 72 h nach Elektroporation hin. Gleichzeitige Schnitte an den benachbarten Loci CCR5 und CCR2 können in seltenen Fällen zu Aberrationen des dazwischen liegenden 15-kb-Fragments führen. Im finalen Zellprodukt wurden kleinste Mengen (<1 Kopie/2000 Zellen) der CCR5-Uco-hetTALEN mRNA gefunden. Im dritten Teil der Arbeit konnte mit Hilfe des CliniMACS Prodigy die erfolgreiche GMP-kompatible Produktion von bis zu 5x10^9 humanen CD4+-T-Zellen mit bis zu 40 % biallelisch CCR5-editierten Zellen gezeigt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit, die bereits in Vorarbeiten entwickelte CCR5-Uco-TALEN zur Herstellung HIV-resistenter T-Zellen für eine klinische Anwendung optimiert und ein GMP-kompatibles Protokoll zur automatisierten Produktion von autologen CCR5-editierten CD4+-T-Zellen im großen Maßstab etabliert.

HIV infections are a treatable but chronic disease that almost always requires lifelong therapy with antiretroviral drugs. The appearance of drug resistance, drug interactions and comorbidities necessitate nevertheless alternative approaches for treating HIV-positive patients. Observations have revealed that knockout of the HIV coreceptor CCR5 (C-C chemokine receptor 5) in HIV target cells leads to resistance to the most abundant HIV strains. The knockout of CCR5 in patients’ own (autologous) cells has therefore been considered a promising gene-therapy approach for HIV-positive patients. The aim of this work was to improve the previously developed designer nuclease CCR5-Uco-TALEN. In the next step, the new, optimized TALEN had to be thoroughly characterized for translation towards clinical application. The final task was the development of a GMP-compatible protocol for large-scale production of CCR5-edited CD4+ T cells. The experiments in the first part of this work on CCR5-Uco-TALEN activity in human T cells confirmed dose-dependent gene editing at the on-target CCR5 and the off-target CCR2. It was also shown that the CCR5-Uco-TALEN activity in most edited cells (76 %) lead to biallelic gene editing in the CCR5 locus. Characterization of other than CCR2 off-targets identified homodimeric TALEN pairs as the main cause for CCR5-Uco-TALEN off-target activity. To eliminate those potential off-targets, the previously used homodimeric Fok1 cleavage domain in the CCR5-Uco-TALEN was exchanged for an obligatory heterodimeric variant. For the novel and highly active CCR5-Uco-hetTALEN no off-targets (except CCR2) could be empirically detected anymore. In the second part of this work, the optimized CCR5-Uco-hetTALEN was characterized in accord with future clinical application. Kinetics studies at the CCR5 and CCR2 locus indicated nuclease activity of CCR5-Uco-hetTALEN only within the first 72 h after electroporation. Simultaneous activity of the CCR5-Uco-hetTALEN at both neighboring loci CCR5 and CCR2 could lead to chromosomal rearrangements of the interjacent 15-kb-fragment. In the final cell product very small residual amounts of CCR5-Uco-hetTALEN mRNA (<1 copy per 2000 cells) were detectable. In the third part of this work, a protocol for the GMP-compatible production of up to 5x10^9 human CD4+ T cells with up to 40 % biallelic CCR5-edited cells was successfully established at the CliniMACS Prodigy.