Funktion von Annexin VI und Caveolin beim intrazellulären Transport von Cholesterin

Abstract

Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktionen von Annexin VI und Caveolin im intrazellulären Cholesterintransport in CHO-Zellen. Cholesterinreiche Lipid Rafts und Caveolae an der Zelloberfläche sind entscheidend am Cholesterintransport beteiligt. Caveolin als Strukturelement der Caveolae bindet und transportiert Cholesterin innerhalb der Zelle. Annexin VI bindet zwar kein Cholesterin, ist aber ebenfalls an der Regulation der Bildung und Stabilität von Lipid Rafts und Caveolae beteiligt. Die Hypothese dieser Arbeit war, dass die Überexpression von dominant negativen Mutanten des Caveolinproteins Cav3(DGV) und Cav1(DGI), die Funktion der Caveolae beeinträchtigt und den Cholesterinefflux stört. Umgekehrt würde eine erhöhte Anzahl von Caveolae in Caveolin 1 überexprimierenden Zellen [Cav1(WT)] eine Steigerung des Cholesterineffluxes zur Folge haben. Überexpression von Annexin VI (anxVI) interferiert mit der Bildung von Lipid Rafts und führt ähnlich den Cav-Mutanten zu einer reduzierten Bildung cholesterinreicher Caveolae. Mit Hilfe radioaktiver Assays wurde der 3H-Cholesterinefflux untersucht. Es zeigte sich eine 15-20%ige Minderung des HDL induzierten Effluxes in anxVI-Zellen gegenüber Wildtyp(WT)-Zellen, was daraufhin weist, dass die Überexpression von Annexin VI die Zellmembran und Lipidzusammensetzung der Zelle verändert, dass der Transport des Cholesterins in Lipid Rafts und Caveolae beeinträchtigt ist und eine Reduktion des Effluxes zur Folge hat. Im Anschluss wurde mittels Immunfluoreszenzen die Lokalisation von Annexin VI und Caveolin beim Cholesterintransport dargestellt. Obwohl Annexin VI nicht im Golgi-Apparat zu finden ist, beeinflusst es die Lokalisation und Konzentration von Caveolin in anxVI-Zellen. Dieser Phänotyp ähnelt dem der Cav3(DGV) Mutante. Somit ist vermutlich der reduzierte Transport von Caveolin vom Golgi-Apparat an die Zelloberfläche für den reduzierten Cholesterinefflux in anxVI-Zellen verantwortlich. Lipid Raft Präparationen der verschiedenen Zellen bestätigten diese Beobachtungen. In Cav1(WT)-Zellen kommt es gegenüber WT-Zellen zu einer Anreicherung von 3H-Cholesterin sowohl in Lipid Rafts, als auch in schweren Membranen, die vorwiegend Plasmamembran und Golgi-Apparat enthalten. Im Gegensatz dazu findet sich 3H-Cholesterin in anxVI- und Cav3(DGV)-Zellen vermehrt in schweren Membranen, was wiederum mit der Akkumulation von Caveolin im Golgi-Apparat in anxVI-Zellen in den Immunfluoreszenzen korreliert. Demzufolge scheint Annexin VI für die Bildung und den Transport von cholesterinreichen Membranstrukturen an die Zelloberfläche und den daran gekoppelten reversen Cholesterintransport enorm wichtig zu sein.