Titel: Functional characterization of interdisulfide-formation in p90 ribosomal S6 kinase 1 (RSK1) in the cardiovascular system
Sprache: Englisch
Autor*in: Schulz, Steven
Schlagwörter: p90 ribsomal s6 kinase 1; Knock-in mouse; Angiotensin II
GND-Schlagwörter: MAP-KinaseGND
Kardiovaskuläres SystemGND
DisulfidbrückeGND
CRISPR/Cas-MethodeGND
Knockin <Molekulargenetik>GND
Erscheinungsdatum: 2021
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-09-10
Zusammenfassung: 
Die p90 ribosomale S6 Kinase (RSK) repräsentiert eines der Hauptsubstrate der extrazellulär regulierten Kinase (ERK) in der Phosphorylierungskaskade des Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Signalweges. Als Mitglied des MAPK Signalweges wurde RSK1 Aktivität in Verbindung mit der Regulation von Gentranskription, Proteintranslation, dem Fortschreiten des Zellzyklus und mit der Krebsentstehung gebracht. Reaktive Sauerstoffspezies sind in der Lage, die Aktivität von Proteinkinasen durch Induktion oxidativer posttranslationaler Modifikationen zu regulieren. Dabei kann beispielsweise eine Phosphorylierung spezifischer Aminosäuren verhindert, aber auch die Aktivität der Kinase durch die Ausbildung von inter- und intramolekularen Disulfidbrücken moduliert werden.
Zweidimensionale Gelelektrophorese und Analyse der RSK1 Krystallstruktur identifizierten Cystein-575 in der C-terminalen Kinasedomäne (CTKD) von RSK1 als oxidationsempfindlich. Dabei wurde eine mögliche intermolekulare Disulfidbrücke zwischen Cystein-575 Aminosäureseitenketten zweier CTKD Monomere beobachtet. Um die funktionelle Bedeutung dieser Oxidation von RSK1 auf die physiologische Funktion der Kinase zu untersuchen, wurde zunächst eine RSK1 Mutante generiert, in welcher das Cystein in Position 575 durch nicht-oxidierbares Glycin ersetzt wurde. Mittels Western Immunoblot Analyse und in vitro Kinaseaktivitätsuntersuchungen in transient-transfizierten HEK293T Zellen mit Wildtyp (WT) RSK1 oder der RSK1 C575G Mutante, konnte kein Unterschied in der Kinaseaktivität festgestellt werden. Die Phosphorylierung von Serin-732 (Ser-732) in RSK1 C575G transfizierten HEK293T Zellen war im Vergleich zu WT RSK1 exprimierenden Zellen signifikant reduziert. Ser-732 spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Interaktion zwischen RSK1 und ERK. Eine reduzierte Phosphorylierung indiziert eine strukturelle Veränderung der CTKD von RSK1, ohne die Phosphorylierung der N-terminalen Kinasedomäne (NTKD) von RSK1 durch die Phosphoinositid-abhängige Kinase 1 (PDK1) oder die Aktivität der NTKD zu beeinflussen. In einem Knock-In (KI) Mausmodell, welche die RSK1 C575G Mutante ubiquitär exprimiert, wurden systemische Unterschiede zu WT Geschwistern nach Gabe des pro-inflammatorischen und blutdrucksteigernden Peptidhormons Angiotensin II (AngII) untersucht. Dauerhafte Exposition mit AngII resultierte in einer signifikant verschlechterten Herzfunktion in KI versus WT Tieren. Darüber hinaus entwickelten diese Tiere einen Auswuchs im linken Atrium, welcher nicht in WT Mäuse nachgewiesen werden konnte. Die Entwicklung des Auswuchses im linken Atrium wurde auf die Proliferation von Zellen des subendokardialen Bindegewebes zurückgeführt, welches sich bis zu den Mitralklappen erstreckt. Eine direkte Beteiligung von Kardiomyozyten konnte ausgeschlossen werden. Den Beitrag von Unterschieden in der Höhe des AngII-induzierten Blutdruckes zwischen Genotypen zur Herzinsuffizienzentwicklung wurde durch radiotelemetrische Blutdruckmessungen ausgeschlossen. Um die grundlegenden Veränderungen des Transkriptoms, welche den beobachteten Phänotyp ursächlich beeinflussen könnten, zu untersuchen, wurden die Atrien und Ventrikel der Tiere nach dreitägiger Exposition mit AngII mittels RNA-Sequenzierung analysiert. Der sich dabei manifestierende Defekt in der Migration von Leukozyten nach AngII Exposition wurde durch quantitative Echtzeit PCR und Migrationsassays in Makrophagen von KI Tieren bestätigt.
Diese Beobachtungen wurden begleitet durch die reduzierte Expression des Monozyten Differenzierungs-Transkriptionsfaktors C/EBP-β und die reduzierte nukleäre Translokation von RSK1 nach Stimulierung. Des Weiteren führte die reduzierte Ser-732 Phosphorylierung von RSK1 zu einer verlängerten Interaktion mit ERK und dadurch zu einer ERK-Retention im Cytosol. Die Verhinderung der nukleären Translokation von ERK verhindert dabei die Induktion des Genprograms zum Erreichen einer kompensatorischen Herzhypertrophie als Reaktion auf den erhöhten kardialen Auswurfswiderstand und prädisponiert damit das Herz von KI Tieren für eine exazerbierte Dilatation und dekompensierte Herzinsuffizienz.

The p90-ribosomal S6 kinase (RSK) is a major substrate of extracellular regulated kinase (ERK) in the MAPK pathway upon mitogen stimulation. As member of the MAPK pathway, RSK1 activity has been implicated in the regulation of gene transcription, protein translation, cell cycle progression, cell survival and cancer formation. During oxidant production, protein kinase signaling has been described to be regulated by oxidative post-translational modifications, preventing protein phosphorylation, or promoting the formation of inter- and intramolecular disulfide bridges thus directly modulating kinase activity. Two-dimensional gel electrophoresis and crystal structure analysis revealed oxidant-susceptibility of Cys-575 in the C-terminal kinase domain (CTKD) of RSK1 thereby potentially formation of an interdisulfide bridge between CTKD monomers.
To investigate the functional impact of RSK1 oxidation for cardiovascular function, a RSK1 Cys 575 mutant that expresses non-oxidizable glycine (C575G) was generated. Western immunoblot analysis and in-vitro kinase assays of HEK293T cells transiently expressing either wildtype (WT) or C575G mutant RSK1 exhibited no significant difference in kinase activity. Phosphorylation of C575G RSK1 at position Ser-732 was significantly reduced. Ser-732 is the key regulatory site for the interaction with ERK. Attenuated phosphorylation at Ser-732 proposed a structural rearrangement of the CTKD without impact on the phosphorylation of the N-terminal kinase domain of RSK1 by phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) and RSK1 kinase activity.
A novel knock-in (KI) mouse model ubiquitously expressing the C575G mutant of RSK1 was compared to WT littermates regarding their response upon administration of the pro inflammatory and pro-hypertensive peptide hormone angiotensin II (AngII). Chronic exposure to AngII resulted in significantly reduced cardiac function and the formation of a left atrial growth in the hearts of KI animals, which was not observed in WT littermates. The development of the left atrial cardiac growth was traced back to the proliferation of sub-endocardial connective tissue reaching to the mitral valve, without participation of cardiomyocytes. Potential differences in the hypertensive response to AngII between KI and WT animals causally contributing to the differences in cardiac function were excluded by radio telemetric blood pressure measurements. To investigate the causative changes resulting in the observed phenotype, RNA sequencing was performed of atria and ventricles upon short term exposure to AngII and differences in the transcriptome were analyzed. This revealed reduced migration of leukocytes in response to AngII exposure, which was validated and confirmed by quantitative real-time PCR as well as chemotaxis and migration assays in macrophages of KI animals. These observations were accompanied by reduced expression of the monocyte differentiation transcription factor C/EBP-β and reduced nuclear translocation of RSK1 upon stimulation. Furthermore, reduced phosphorylation of RSK1 at Ser-732 resulted in retention of ERK1/2 in the cytosol, preventing its nuclear translocation and thereby preventing the induction of compensated cardiac hypertrophy in response to increased cardiac afterload, predisposing the hearts of KI animals to dilation and decompensation.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9380
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-97230
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Cuello, Friederike
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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