Titel: BioID2- and APEX2-based lipid droplet proteome analysis reveals new host factors for hepatitis C virus replication
Sprache: Englisch
Autor*in: Bley, Hanna
Schlagwörter: Hepatitis C Virus; Lipid Droplets; Proximity Labeling; LARP1; Viral Host Factors
Erscheinungsdatum: 2021
Tag der mündlichen Prüfung: 2022-01-21
Zusammenfassung: 
With the growing opioid crisis in the USA, hepatitis C virus (HCV) infection rates increase and lead to a demographic shift towards young individuals. However, due to mild symptoms many infections remain unrecognized until chronic infection and inflammation cause severe liver damage years later. The introduction of direct-acting antivirals (DAA) has offered potent treatment options for HCV infections, but HCV remains a serious health concern, since a vaccine is not available. The HCV viral life cycle is tightly connected to the host lipid metabolism with lipid droplets (LDs) serving as viral assembly sites. Perilipin (PLIN) 2, the major LD-decorating protein in hepatocytes, has been shown to play an important role in HCV morphogenesis, as it is required for the formation of infectious HCV particles. A previous LD proteome analysis revealed that an HCV infection considerably changes the protein composition at LDs in Huh7.5 cells. In that study, annexin A3 (ANXA3) has been identified as an important host factor for HCV that redistributes to LD fractions and is required for HCV particle maturation and egress.
In this study, proximity labeling of the above-mentioned proteins was performed to further characterize the molecular details of the later steps of the HCV viral life cycle. The biotin ligase BioID2 as well as the engineered ascorbate peroxidase APEX2 were genetically fused to PLIN2 or ANXA3 to identify proteins in spatial vicinity of LDs in HCV-infected cells by mass spectrometry. Therefore, HCV-infected and uninfected Huh7.5 cells stably expressing the respective fusion proteins were prepared for SILAC labeling to identify differences in ANXA3 and PLIN2-proximal proteins. Biotinylated proteins identified by mass spectrometry were investigated for their putative roles in the HCV life cycle. Here, the proteins FABP5 (fatty acid-binding protein 5), ARL8B (ADP ribosylation factor-like protein 8B), SART3 (RNA-binding protein squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3; also known as TIP110), NOB1 (NIN1-binding binding protein 1), and LARP1 (La-related protein 1) were investigated. The data revealed ARL8B, SART3, NOB1, and LARP1 as host factors for HCV replication. Focusing on LARP1 in greater detail, a core-dependent recruitment to LDs was observed by western blotting and immunofluorescence analysis. Additionally, LARP1 interacted with core in an RNA-dependent manner, even in the absence of infection. Knockdown of LARP1 decreased HCV spreading without altering HCV RNA replication or viral titers. Isolated LD fractions of HCV-infected cells as well as microscopic analyses showed an impaired recruitment of the viral proteins core and NS5A to LDs in LARP1-knockdown cells. Immunofluorescence staining of HCV double-stranded RNA (dsRNA) indicated a reduced signal intensity of dsRNA foci, as well as decreased colocalization of dsRNA with LDs in infected LARP1-knockdown cells. In addition, LARP1 depletion caused a significant decrease in cell-to-cell transmission.
Taken together, this study expands the role of LARP1 as an HCV host factor that is most likely involved in the later steps of the viral life cycle, contributing to cell-to-cell transmission.

Steigende Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektionsraten und die wachsende Opioidkrise in den USA zeigen eine demografische Verschiebung der Infektionslast hin zu jüngeren Menschen. Aufgrund der leichten Symptomatik bleiben viele Infektionen unerkannt, bis eine chronische Infektion Jahre später schwere Leberschäden verursacht. Die Einführung direkt wirkender antiviraler Medikamente (direct-acting antivirals, DAA) ermöglicht eine wirksame Behandlungsmöglichkeit für HCV Infektionen. Da kein Impfstoff zur Verfügung steht, bleibt HCV jedoch ein ernstzunehmendes Problem.
Der Lebenszyklus des HCV ist eng mit dem Lipidstoffwechsel des Wirts verbunden, wobei lipid droplets (LDs) als virale Assemblierungsplattformen dienen. Perilipin (PLIN) 2, das Hauptprotein an der LD-Oberfläche in Hepatozyten, spielt eine wichtige Rolle bei der HCV-Morphogenese, da es für die Bildung infektiöser Partikel benötigt wird. Eine frühere LD-Proteomanalyse ergab, dass eine HCV-Infektion die Proteinzusammensetzung an LDs in Huh7.5-Zellen erheblich verändert. In dieser Studie wurde Annexin A3 (ANXA3) als wichtiger Wirtsfaktor für HCV identifiziert, der in infizierten Zellen an die LDs rekrutiert wird und für die Reifung und den Austritt von HCV-Partikeln erforderlich ist.
In dieser Dissertation wurde ein proximity labeling der oben genannten Proteine durchgeführt, um die molekularen Details der späteren Schritte des HCV-Lebenszyklus weiter zu charakterisieren. Die Biotinligase BioID2 sowie die gentechnisch veränderte Ascorbatperoxidase APEX2 wurden an PLIN2 oder ANXA3 fusioniert, um Proteine in räumlicher Nähe von LDs in HCV-infizierten Zellen durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Dafür wurden HCV-infizierte und nicht-infizierte Huh7.5-Zellen, die die jeweiligen Fusionsproteine stabil exprimierten, mittels SILAC analysiert, um die durch eine Infektion hervorgerufenen Unterschiede in ANXA3- und PLIN2-proximalen Proteinen zu ermitteln. Durch Massenspektrometrie identifizierte biotinylierte Proteine wurden auf ihre mutmaßliche Rolle im HCV-Lebenszyklus untersucht. Hierbei wurden die Proteine FABP5 (fatty acid-binding protein 5), ARL8B (ADP ribosylation factor-like protein 8B), SART3 (RNA-binding protein squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3; auch bekannt als TIP110), NOB1 (NIN1-binding binding protein 1) und LARP1 (La-related protein 1) charakterisiert und ARL8B, SART3, NOB1 und LARP1 als HCV-Wirtsfaktoren identifiziert. Mit besonderem Fokus auf LARP1 wurde eine Core-abhängige Rekrutierung zu LDs durch Westernblot und Immunfluoreszenzanalysen beobachtet. Darüber hinaus interagierte LARP1 RNA-abhängig mit Core, auch in Zellen, die nicht infiziert waren. Der Knockdown von LARP1 verringerte die HCV-Vermehrung, ohne die HCV-RNA-Replikation oder die Virustiter zu verändern. Isolierte LD-Fraktionen von HCV-infizierten Zellen sowie mikroskopische Analysen zeigten eine verminderte Rekrutierung der viralen Proteine Core und NS5A zu LDs in LARP1-Knockdownzellen. Immunfluoreszenzfärbung von HCV doppelsträngiger RNA (dsRNA) zeigte eine verringerte Signalintensität von dsRNA-Foci sowie eine verringerte Kolokalisierung von dsRNA mit LDs in infizierten LARP1-Knockdownzellen. Zudem reduzierte die Depletion von LARP1 die direkte Zell-zu-Zell-Übertagung (cell-to-cell transmission) von HCV signifikant.
Zusammenfassend erweitert diese Dissertation das Verständnis von LARP1 als HCV-Wirtsfaktor, der höchstwahrscheinlich an den späteren Schritten des viralen Lebenszyklus beteiligt ist und zur direkten Virusübertragung von Zelle zu Zelle beiträgt.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9446
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-98408
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Herker, Eva
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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