Titel: Pharmacokinetics and Metabolism: Analysis of Low-abundant Deamidation and Oxidation Modifications in Therapeutic Species in Complex Biological Matrices by Liquid Chromatographic and Mass Spectrometry Methods
Sprache: Englisch
Autor*in: Mena Pérez, Sandra Carolina
Erscheinungsdatum: 2021-06
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-11-26
Zusammenfassung: 
Die Charakterisierung und Quantifizierung von Modifikationen wie die Deamidierung, die in therapeutischen Proteinen nach deren Injektion in das Blut von Patienten auftreten können, sind von immenser Bedeutung, da sie pharmakokinetische Folgen nach sich ziehen können. LC-MS/MS-basierte Methoden, die mehrere Modifikationen in präklinischen/klinischen Studien gleichzeitig überwachen, gibt es kaum. Eine Analyse von therapeutischen Proteinen im Blut von Patienten ist besonders anspruchsvoll, da ähnliche körpereigene Proteine in diesen Proben vorhanden sind. Pertuzumab ist einvollständig rekombinanter, humanisierter monoklonaler Antikörper (MAK), der für die Behandlung von HER2-positivem, metastatischem Brustkrebs genutzt wird. Wie andere MAKs kann Pertuzumab nach der Anwendung Biotransformationen unterliegen. Dennoch wurden Methoden, die in vivo den Abbau von Pertuzumab überwachen und aufLC-MS/MS-Methoden basieren, bisher nicht entwickelt. In dieser Arbeit war es das Zieleine LC-MS/MS-Methode zu erarbeiten, mit der die gering abundanten Deamidierungs-und Oxidationsmodifikationen in Pertuzumab in Serum quantifiziert werden können. Hierfür wurden verschiedene Proben-Vorbereitungsverfahren für die Verdauung der Proben in Bezug auf Verdauungseffizienz und Deamidisierungs-/Oxidationsniveau verglichen, welche als Nebenreaktionen durch die Probenvorbereitungsbedingungen verursacht wurden. Mittels LC-MS/MS-Analysen wurden die Aminosäuren identifiziert, die besonders empfindlich gegenüber Deamidierungs- und Oxidationsmodifikationen sind und die pharmakokinetische Relevanz besitzen und die zugehörigen tryptischen Peptide für die weitere Methodenentwicklung ausgewählt. Eine Umkehrphasen-LC-Chromatographiewurde solange optimiert, bis eine Basislinientrennung zwischen den amidierten und deamidierten Spezies erreicht wurde. MS-basierte gezielte Methoden wie PRM (parallel reaction monitoring) und SRM (selected reaction monitoring) wurden angewandt und bezüglich Sensitivität und Spezifizität verglichen. Sensitivität, Robustheit und Reproduzierbarkeit in einer optimierten PRM-Methode wurden auf einer unteren Quantifizierungsgrenze von 2ug/ml für Pertuzumab in Kaninchenserum erzielt. Die entwickelte Methode wurde gemäß FDA-Richtlinien validiert und alle untersuchten Kriterien für eine bioanalytische Methodenvalidierung wurden erfüllt. Während der Methodenvalidierung wurden verschiedene Quantifizierungsstrategien untersucht, die alle auf dem relativen internen Standard (IS) basierten, um sich einer akuraten Quantifizierungsrate unter Berücksichtigung von Matrixeffekten in Serum zu nähern. Es konnte ein erhöhte Matrixeffekte in individuellen Seren im Vergleich zu Serumsammelproben beobachtet werden. Schließlich wurden Genauigkeit und Präzision bei der Quantifizierung von niedrig abundanten modifizierten Peptiden durch die IS-basierte Quantifizierungsstrategie erreicht. Die validierte Methode wurde verwendet, um Deamidierungs- und Oxidationsratenzwischen in-vivo- und in-vitro-Proben im zeitlichen Verlauf zu untersuchen und zu vergleichen. Interessanterweise wurde eine individuelle Variabilität der Deamidierungsraten in vivo im Zeitablauf festgestellt. Zudem unterschieden sich die Deamidierungsraten über die Zeit unter denselben Bedingungen zwischen in-vivo- undin-vitro-Modellen. Aus diesem Grund war es nicht möglich, ein in-vitro-Modell, das angereicherte Serumsammelproben nutzt, zur Vorhersage von in-vivo-Deamidierung bei individuellen Kaninchen zu verwenden. Dennoch konnte eine Korrelation zwischen Deamidierungsraten, die im Zeitablauf in der Fc-Region auftraten, und Deamidierungsraten, die in der CDR-Region auftraten, in Kaninchen beobachtet werden. Dies erlaubt es, Abbauuntersuchungen, die sich auf die Fc-Region fokussieren, als Indikator für die Empfindlichkeit gegenüber Modifizierungsreaktionen in CDR-Regionen heranzuziehen. Zusammenfassend können die Ergebnisse dieser Arbeit als Basis für Studien zur MAK-Stabilität und deren Empfindlichkeit gegenüber Modifizierungsreaktionen in vivo dienen. Die vorgeschlagene IS-basierte Strategie für eine akurate Quantifizierung trotz Matrixeffekt ist auf die Untersuchung jedes beliebigen MAKs und jeder beliebigen Modifikation auf Peptidniveau übertragbar. Die optimierte Probenverdauung ist für Bottom-Up-Studien anwendbar, in denen geringe Deamidierungs- und Oxidationsnebenreaktionen wichtig sind. Der beobachtete Unterschied in Bezug auf Deamidierungsneigung für Fc- und CDR-Regionen zwischen verschiedenen MAKs ist auch von Interesse, wenn es um die Untersuchung von Protein-3D-Strukturen und um die Stabilität für Biotherapeutika und Biosimilars geht.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9495
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-99094
Dokumenttyp: Dissertation
Bemerkung: This thesis has been purposely blinded for confidentiality reasons.
Betreuer*in: Schlüter, Hartmut
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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