Gegenseitige Beeinflussung von CD24, CD44 und CD133 in humanen Kolonkarzinomzellen und ihre Bedeutung für die spontane Metastasierung im Xenograftmodell

Abstract

Hintergrund: Krebserkrankungen sind in unserer Gesellschaft weit verbreitet. Weltweit sind im Jahr 2020 19,3 Millionen neue Krebsfälle und fast 10,0 Millionen Krebstodesfälle aufgetreten. Darmkrebs (CRC) ist das dritthäufigste Malignom weltweit und ist besonders im metastasierten Stadium mit einer sehr schlechten Prognose assoziiert. Obwohl vor allem die Metastasierung die primäre Todesursache für >90% der Krebspatienten darstellt, bleiben viele Prozesse und Regulationsschritte unverstanden. In jüngerer Vergangenheit lieferten u.a. die Tumorstammzellhypothese und die Entdeckung potenzieller Stammzellmarker wichtige neue Erkenntnisse zum besseren Verständnis der Tumormetastasierung.

Ziele: Diese Dissertation sollte zwei Fragestellungen beantworten: (1) Wie verändern sich die Expressionslevel der potenziellen Stammzellmarker CD133, CD24 und CD44 nach KD von CD44 und CD24 in verschiedenen Zelllinien humaner GI-Tumore und ergeben sich Hinweise auf eine gegenseitige Beeinflussung? (2) Lässt sich, nach Identifikation einer Kandidaten-Zelllinie, im Xenograftmodell erstmals direkte funktionelle Evidenz für den Einfluss der Marker auf die spontane hämatogene Metastasierung in die Lunge gewinnen?

Methoden: Vier Zelllinien humaner gastrointestinaler Adenokarzinome mit bereits vorliegendem KD von CD24 bzw. CD44 (zwei PDAC Zelllinien und zwei CRC Zelllinien) wurden mit Hilfe einer Durchflusszytometrie auf die Markerexpression hin untersucht. Aufgrund des beobachteten Einflusses des CD24-KD und CD44-KD auf CD133 bei der Zelllinie HT29 wurden anschließend weitere Derivate dieser Linie mit einem KD von CD133 hergestellt und mittels Durchflusszytometrie untersucht. Aufgrund der offenbar gegenseitigen Beeinflussung von CD133 und CD24 bei der Linie HT29 wurde im nächsten Schritt ein Doppel-KD von CD133 und CD24 angestrebt, hiernach entstanden vier neue Zelllinienderivate: Kontrolle („luc-neg“), CD133-Einzel-KD („neg-shCD133“), CD24-Einzel-KD („luc-shCD24“) und CD133/CD24-Doppel-KD („shCD133/shCD24“). Diese wurden nach Messung der Markerexpression in immundefiziente Xenograftmodelle injiziert, um den Effekt der Depletion eines der Stammzellmarker auf das Tumorwachstum und die spontane Metastasierung in vivo zu analysieren. Aus den Versuchstieren wurden nach Erreichen eines der Endpunkte Vollblut, beide Lungenflügel und die Xenograft-Primärtumore entnommen. Um die humane (metastatische) Zelllast in Blut und Lungengewebe der Versuchstiere zu bestimmen, wurde im Anschluss eine Alu-PCR durchgeführt. Die Xenograft-Primärtumore sowie das Lungengewebe wurden anschließend immunhistochemisch auf die Markerexpression hin untersucht. Um die Proteinmengen an CD24 und CD44 in den Xenograft-Primärtumoren genauer zu quantifizieren, wurden diese zusätzlich mittels Western Blot Analysen untersucht.

Ergebnisse: Unter den vier untersuchten Zelllinien reagierte nur HT29 mit sekundären Effekten auf den KD von CD24 und CD44, in beiden KDs zeigte sich eine signifikante Reduktion der CD133-Expression. Im daraufhin generierten KD von CD133 zeigte sich der gegenteilige Effekt, nämlich eine deutliche Heraufregulation von CD24. In den auf diesen Befunden aufbauenden generierten 4 „neuen“ Zelllinien zeigte sich sowohl im „neuen“ Einzel-KD von CD24 als auch im Doppel-KD von CD133/ CD24 eine erhöhte CD44 Expression. In vivo führte der Einzel-KD von CD133 zu einem signifikanten Anstieg der Metastasenlast im Lungengewebe. Bei Doppel-KD von CD133/CD24 war die Lungenmetatasenlast wieder unverändert, jedoch die CTC-Last im Blut reduziert. Im Einzel-KD von CD24 war die Lungenmetastasenlast nicht verändert. In der abschließenden Analyse der Proteinmengen von CD24 und CD44 in den s.c. gewachsenen Xenograft-Primärtumoren mittels Western Blot zeigte sich, dass die Menge an CD24 in den Xenografttumoren auch nach in vivo-Wachstum beim CD133 Einzel-KD signifikant erhöht war. Für CD44 zeigte sich eine signifikante Steigerung des CD44-Gehalts in den CD24-Einzel-KD-Tumoren, jedoch nicht in den CD133/ CD24-Doppel-KD-Tumoren.

Zusammenfassung: Die in dieser Arbeit gewonnen Daten legen nahe, dass sich die ausgewerteten CSC-Marker gegenseitig beeinflussen können. Der Ausprägungsgrad eines solchen Einflusses scheint dabei von Tumor zu Tumor unterschiedlich, wie auch die generelle Markerexpression für jedes Karzinom individuell verschieden ist. Vor allem für CD24 und CD133 konnte ein direkter Einfluss auf die hämatogene Metastasierung gezeigt werden, da ein KD beider Marker die Zahl der CTCs im Vollblut signifikant reduzierte. Gleichzeitig jedoch steigerte ein CD133-Einzel-KD die spontane Metastasierung von humanen CRC-Zellen in die Lunge. Sofern CD133 als tatsächlicher CSC-Marker im CRC betrachtet werden kann, erscheint die traditionelle Vorstellung, dass CSC diejenigen Primärtumorzellen sind, die Metastasen hervorbringen, vor dem Hintergrund dieser Arbeit als zu einfach. Umso wichtiger ist die Erkenntnis, dass der CD133-KD sich auch auf die Expression von CD24 auswirkt. Bisher gibt es kaum direkte funktionelle Evidenz für den Einfluss der beiden Marker auf die Tumormetastasierung in vivo. Dies sollte in weiterführenden Studien genauer untersucht werden. Zusätzlich sollte über die isolierte Betrachtung der Marker-Expressionsmuster hinausgegangen und die Marker inklusive ihrer Signaltransduktionskaskaden untersucht werden, um genauere Aussagen über eine potenzielle gegenseitige Beeinflussung treffen zu können.