Histone methyltransferase G9a drives inflammation-induced neurodegeneration by transcriptional control of ferroptosis

Abstract

Neurodegeneration is a major contributor to neurological disability in MS. Current therapies focus on immune modulation but are only poorly effective in halting disease progression. Thus, the development of therapeutics that counteract neurodegeneration by enhancing neuronal resilience to inflammation is a major unmet clinical need in MS. A fundamental pathological feature in affected neurons is the transcriptional dysregulation that mediates a variety of pathways that result in the decay of neurons. Epigenetic modifiers control the transcriptional landscape in a broad fashion and thereby emerges as viable tool to rebalance the deregulated transcriptional response in injured neurons. A clear understanding of epigenetic processes within neurons of MS patients might deliver new strategies for the development of epigenetic therapies. Thus, the goal of this project was to investigate the epigenetic regulation in the mouse model of MS and identify pathways that can be targeted to modulate neuronal susceptibility during inflammation. By in vivo translatome profiling of inflamed neurons, the histone methyltransferase G9a was identified as a driver of inflammation-induced neuronal loss. G9a-dependent epigenetic repressive mark H3K9me2 has been found to be upregulated during glutamate excitotoxicity in vitro and in the MS mouse model in vivo. Pharmacological inhibition and genetic disruption of G9a improved neuronal viability and prevented toxic calcium accumulation during glutamate exposure and oxidative stress. Moreover, G9a inhibition resulted in an improved clinical outcome and reduced neuronal loss in the EAE model. By the investigation of the underlying molecular mechanisms that drive neuronal resilience upon G9a inactivation, the programmed cell death pathway ferroptosis was identified to be controlled by G9a activity in neurons. Thereby, glutamate excitotoxicity induced ferroptosis and led to the depletion of intracellular glutathione levels, both of which could be reversed by G9a inhibition. Additionally, induction of ferroptosis was selectively diminished by G9a interference. Of note, ferroptosis was identified as a pivotal mechanism in neuroinflammation that induces neuronal cell death by the initiation of lipid peroxidation in the acute and chronic phase of the MS mouse model. G9a controlled the initiation of ferroptosis by transcriptionally de-repressing anti-ferroptosis genes in the glutathione/GPX4 axis that resulted in ferroptosis inhibition as measured by lower 4-HNE levels during EAE. Furthermore, enhanced G9a activity was validated in brains of MS patients. Accordingly, GPX4 transcript levels were reduced, highlighting the implication of ferroptosis in neuronal cell death initiation of MS patients. The applicability of G9a inhibitor was explored in human iPSC derived neurons, where G9a inactivation prevented the induction of H3K9me2 during ferroptosis and initiated the expression of anti-ferroptosis genes. These findings indicate a role of G9a as inflammation-induced epigenetic modulator of ferroptosis genes in neurons and suggests pharmacological G9a inhibition as a promising therapeutic approach to counteract neurodegeneration.

Die Neurodegeneration ist einer der Hauptgründe für neurologische Beeinträchtigung in der MS. Die derzeitigen Therapien konzentrieren sich auf die Modulation des Immunsystems, sind aber nur wenig wirksam, um das Fortschreiten der Krankheit aufzuhalten. Daher ist die Entwicklung von Therapeutika, die der Neurodegeneration entgegenwirken, indem sie die Widerstandsfähigkeit der Neuronen gegenüber Entzündungen stärken, ein wichtiger ungedeckter klinischer Bedarf bei MS. Ein grundlegendes pathologisches Merkmal der betroffenen Neuronen ist die Dysregulation der Transkription, die eine Vielzahl von Signalwegen beeinflusst, was zum Untergang der Neurone führen kann. Epigenetische Modulatoren kontrollieren die Transkription weitreichend und stellen somit ein Instrument dar, um die deregulierte Transkriptionsantwort in geschädigten Neuronen wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Ein klares Verständnis der epigenetischen Prozesse in den Neuronen von MS Patienten könnte neue Strategien für die Entwicklung epigenetischer Therapien liefern. Ziel dieses Projekts war es daher, die epigenetische Regulierung im Mausmodell der MS zu untersuchen und Wege zu identifizieren, die gezielt zur Beeinflussung der neuronalen Anfälligkeit während der Entzündung eingesetzt werden können. Durch in vivo Translatom Untersuchungen entzündeter Neuronen wurde die Histon-Methyltransferase G9a als eine treibende Kraft für den entzündungsbedingten neuronalen Verlust identifiziert. Es wurde festgestellt, dass die von G9a vermittelte, epigenetische Modifizierung H3K9me2 bei Glutamat Exzitotoxizität in vitro und im MS-Mausmodell in vivo hochreguliert wird. Die pharmakologische Hemmung und genetische Deletion von G9a verbesserte die neuronale Lebensfähigkeit und verhinderte die toxische Kalziumakkumulation bei Glutamat Exposition und oxidativem Stress. Darüber hinaus führte die Hemmung von G9a zu einem verbesserten klinischen Ergebnis und einem geringeren Neuronenverlust im EAE-Modell. Durch die Untersuchung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, die die neuronale Resilienz bei G9a-Inaktivierung steuern, wurde festgestellt, dass der programmierte Zelltodweg Ferroptose durch die G9a-Aktivität in Neuronen kontrolliert wird. Dabei induzierte die Glutamat Exzitotoxizität die Ferroptose und führte zu einer Verminderung des intrazellulären Glutathionspiegels, was durch die Hemmung von G9a verhindert werden konnte. Darüber hinaus wurde die Induktion der Ferroptose durch G9a-Interferenz selektiv verhindert. Zudem wurde die Ferroptose als ein zentraler Mechanismus bei der Neuroinflammation identifiziert, der den neuronalen Zelltod durch die Auslösung der Lipidperoxidation in der akuten und chronischen Phase des MS Mausmodells auslöst. G9a verminderte die Einleitung der Ferroptose durch transkriptionelle Depressionen von Anti-Ferroptose Genen, die in der Glutathion/GPX4-Achse beteiligt sind. Die Hemmung der Ferroptose konnte durch eine geringere Freisetzung von 4-HNE während der EAE gemessen werden. Darüber hinaus wurde in Gehirnen von MS-Patienten eine erhöhte G9a-Aktivität nachgewiesen. Dementsprechend war das GPX4 Transkript reduziert, was die Bedeutung der Ferroptose bei der Auslösung des neuronalen Zelltods bei MS-Patienten unterstreicht. Die Anwendbarkeit von G9a-Inhibitoren wurde an menschlichen iPSC-Neuronen untersucht, bei denen die Inaktivierung von G9a die Induktion von H3K9me2 während der Ferroptose verhinderte und die Expression von Anti-Ferroptose-Genen erhöhte. Diese Ergebnisse weisen auf eine Rolle von G9a als entzündungsgetriebener epigenetischer Modulator von Ferroptose-Genen in Neuronen hin und legen eine pharmakologische G9a-Inhibition als vielversprechenden therapeutischen Ansatz zur Bekämpfung der Neurodegeneration nahe.