Titel: Investigation of The Role of Glycan Binding on Human Norovirus Using Mass Spectrometry
Sprache: Englisch
Autor*in: Yan, Hao
Erscheinungsdatum: 2021
Tag der mündlichen Prüfung: 2022-03-30
Zusammenfassung: 
Im Rahmen des ersten Projekts wird die Bindungsstärke zwischen dem Norovirus-P-Dimer und den Blutgruppenkohlenhydraten mit Hilfe der nativen MS bestimmt. Acht nicht-glykanbindende Proteine wurden für die Bewertung des Grades der Glykanclusterung ausgewählt. Ein Galaktose-terminaler Nicht-Binder-Ligand Gb4 wird als negative Kontrolle zum Vergleich mit dem zu untersuchenden Kohlenhydrat verwendet. Das deutliche Glykan-Cluster-Muster bei den Referenzkandidaten deutet darauf hin, dass die physikochemische Eigenschaft des Proteins die Glykan-Clusterbildung während der Elektrospray-Ionisierung über die native MS beeinflusst. Die ausführliche Datenanalyse ergibt, dass der Anteil der β-Sheets-Struktur in einem Protein einen erheblichen Einfluss auf den Grad der Ligandenclusterung der Glykane hat. Ein großes Protein mit einem hohen Anteil an β-Faltblättern führt zu einem starken Ligandenclustering. Somit ist ein geeignetes nicht-glykanbindendes Referenzprotein für eine direkte MS-Studie von entscheidender Bedeutung und die bisherige Interpretation der Bindungskonstante von Glykanliganden an die P-Dimere ist zu berücksichtigen.

Bislang wurde Fucose als minimale Bindungskomponente während der Zellanhaftung des Norovirus nachgewiesen. Die röntgenkristallografische Beobachtung ergab, dass sich die Bindungspunkte im Bereich des Spalts zwischen zwei humanen Norovirus (hNoV) P-Monomeren befinden. Im zweiten Teil der Studie wird untersucht, ob das P-Dimer ein Mehrfachbindungsverhalten aufweist. Mit Hilfe der Festphasen-Polymersynthese werden einige multivalente, an Fucose gebundene Glykomakromoleküle erzeugt und zur Bestimmung der globalen Avidität mit dem P-Dimer in Wechselwirkung gebracht. Dazu wurden neun glykanverknüpfte Strukturen mit unterschiedlicher Fucose/Galactose-Anzahl und Position auf dem Oligo-Rückgrat konstruiert und mit native MS analysiert. Aus dem Ergebnis geht hervor, dass die erste Generation der fucosehaltigen Strukturen eine vergleichbare Bindungsaffinität (im mM-Bereich) aufweist. Dies deutet darauf hin, dass nur eine Fucose pro Glycomakromolekül die Bindungstasche der P-Dimere einnimmt.

Durch NMR und Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) wurde eine Post-Modifikationsstelle (N373) in der Nähe der Glykan-Bindungsregion des Norovirus GII.4 Saga P-Dimers nachgewiesen. In Verbindung mit Blutgruppenantigen-Kohlenhydraten wurde eine Abschwächung der Bindung an die deamidierten P-Dimere beobachtet. Im dritten Projekt wurden drei Norovirus-Stämme, GII.4 MI001, GII.17 Kawasaki und GII.10 Vietnam206 P-Dimer-Proteine dargestellt und mit HDX MS in Gegenwart von Fucose und Blutgruppenantigen B-Tri-Sacchariden gemessen, um zu untersuchen, ob die Deamidierung an den P-Dimeren dieser Arten erfolgt und wie das Glykan-Bindungsmuster reagiert. Nach Sequenzabgleich und Peptidzuordnung. Das Ergebnis ergab, dass das deamidierte GII.4 MI001 P-Dimer nach mehrmonatiger Lagerung bei pH7 nachgewiesen werden kann. Bei den Dimeren GII.17 Kawasaki und GII.10 Vietnam206 P wurde keine Deamidierung gefunden, obwohl das Vietnam-Dimer ein Glutamin (das deamidiert werden kann) an Position 373 des Glykanbindungsspalts trägt, ähnlich wie die GII.4 Saga-Stämme. Zudem wurde eine vergleichbare Dynamik der Glykanbindung zwischen den beiden Domänen GII.4 Saga und MI001 P aufgrund von Struktur- und Sequenzähnlichkeit festgestellt. Die Arten GII.17 Kawasaki und GII.10 Vietnam zeigen ein unterschiedliches Schutzverhalten während des H/D-Austauschs. Das unterschiedliche Ligandenbesetzungsverhalten der verschiedenen P-Dimere deutet darauf hin, dass die Glykanbindung bei Noroviren stammspezifisch ist.

Native MS und HDX MS dienen der Untersuchung der Rolle der Glykanbindung an Noroviren. Wir belegen, dass die unspezifische Clusterbildung von einer intrinsischen Eigenschaft des Proteins bestimmt wird. Durch die Untersuchung der natürlichen Glykane und der entwickelten Glykomakromoleküle, die über die native MS an das P-Dimer des Norovirus binden, werden nützliche Informationen für die Entwicklung einer neuartigen Antidrogenstrategie zur Hemmung der viralen Zellanhaftung gewonnen. Demgegenüber lässt die stammabhängige Dynamik der Glykananbindung und des Deamidierungsprozesses in den verschiedenen Norovirenstämmen, die mittels HDX-MS bestimmt wurden, darauf schließen, dass die viralen Partikel eine spezifische Infektionsstrategie während der Interaktion zwischen Wirt und Virus verfolgen.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9643
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-101027
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Uetrecht, Charlotte
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

Dateien zu dieser Ressource:
Datei Beschreibung Prüfsumme GrößeFormat  
20220617 dissertation-haoyan(1).pdfDissertation05632ca0a277e33696c69b25d69f63675.55 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen
Zur Langanzeige

Info

Seitenansichten

29
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.06.2022

Download(s)

13
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.06.2022
Werkzeuge

Google ScholarTM

Prüfe