Relevance of Oxysterol 7-Alpha-Hydroxylase (CYP7B1) for Lipid Metabolism and Fatty Liver Disease

Abstract

Cold exposure and the simultaneous brown adipose tissue (BAT) activation are important determinants of metabolic processes such as carbohydrate and lipid metabolism. Recently, a new interplay between BAT and the liver was identified under which increased lipoprotein processing in the thermogenic organ triggers the hepatic synthesis of bile acids via alternative synthesis pathway. This process relies on the cold-dependent upregulation of oxysterol 7-α hydroxylase (CYP7B1), which mediates the conversion of hepatic cholesterol excess into bile acids, subsequently influencing gut microbiome composition as well as thermogenic responses of the host. The purpose of this thesis was firstly to elaborate on the conditions as well as the factors that may contribute to this mechanism in mice. Acute cold exposure was identified insufficient of triggering the alternative synthesis pathway, as a minimum of 3-day acclimation was necessary to induce hepatic Cyp7b1 expression. This induction was further found to be dependent on the magnitude of cold stress, as housing at both 6oC and 16oC efficiently promoted while mild cold-stress (22oC) did not affect the levels of Cyp7b1 after a short-time acclimation. Regarding the regulation of Cyp7b1 upon cold exposure, fasting-refeeding studies as well as pharmacological inhibition of Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) and 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase (HMGCR) pointed towards a negligible role of insulin signaling and cholesterol absorption/synthesis, respectively. On the other hand, RAR-related orphan receptor alpha (RORα) agonism positively regulated Cyp7b1 and increased bile acid synthesis upon cholesterol-enriched high-fat diet, but further investigation is required to delineate its importance for the enzyme’s transcriptional activation during cold exposure. Additionally, this thesis studied the relevance of Cyp7b1-derived bile acids in systemic metabolism via organ uptake studies with radioactive tracers in wild type (WT) and Cyp7b1-/- mice housed at thermoneutral or cold environments. Diminished BAT uptake of 3H-triolein and 14C-choesterol in cold acclimated Cyp7b1-/- mice underscored the importance of bile acids derived from the alternative synthesis pathway in the activation and establishment of thermogenic responses. In the context of chronic metabolic diseases, it is of note that ambient temperature, apart from being an important determinant of the alternative bile acid synthesis, largely affects the progression of metabolic-associated fatty liver disease (MAFLD). Therefore, the involvement of CYP7B1 in the etiology of MAFLD under conditions of low and high energy expenditure was finally investigated. For this purpose, two experimental approaches were followed, under which Cyp7b1−/− and wild type mice were fed with either a methionine-choline deficient (MCD) or a choline-deficient high-fat diet (CD-HFD) and were housed at 30 °C (thermoneutrality) or at 22 °C (mild cold stress). To study the disease phenotype and underlying mechanisms, plasma and organ samples were analyzed to determine metabolic parameters, immune cell infiltration by immunohistology and flow cytometry, lipid species including hydroxycholesterols, bile acids and structural lipids. During the MCD study, the chosen duration of mild cold exposure did not upregulate the alternative synthesis pathway, so we couldn’t conclude on a significant role for CYP7B1 in relation to MAFLD-associated parameters. However, in the CD-HFD induced model, thermoneutral housing promoted MAFLD in both WT and Cyp7b1−/− mice, with the effect being more pronounced in CYP7B1-deficient mice. In these mice, we found higher plasma alanine aminotransferase activity, hyperlipidemia, hepatic accumulation of potentially harmful lipid species, aggravated liver fibrosis, increased inflammation and immune cell infiltration. Bile acids and hydroxycholesterols did not correlate with aggravated MAFLD in Cyp7b1−/− mice housed at thermoneutrality. Notably, an up-regulation of lipoprotein receptors was detected at 22 °C but not at 30 °C in livers of Cyp7b1−/− mice, suggesting that accelerated metabolism of lipoproteins carrying lipotoxic molecules counteracts MAFLD progression. In summary, these studies show the pathophysiological relevance of the CYP7B1-dependent alternative bile acid synthesis pathway for the progression of MAFLD.

Kälteexposition und die gleichzeitige Aktivierung des braunen Fettgewebes (BAT) sind wichtige Determinanten von Stoffwechselprozessen wie dem Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel. Kürzlich wurde ein neues Zusammenspiel zwischen BAT und der Leber identifiziert, bei dem eine erhöhte Lipoproteinverarbeitung in dem thermogenen Organ die hepatische Synthese von Gallensäuren über den alternativen Syntheseweg auslöst. Dieser Prozess beruht auf der kälteabhängigen Hochregulierung der Oxysterol-7-α-Hydroxylase (CYP7B1), die die Umwandlung des hepatischen Cholesterinüberschusses in Gallensäuren vermittelt und in Folge die Zusammensetzung des Darmmikrobioms sowie die thermogenen Reaktionen des Wirts beeinflusst. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Bedingungen sowie die Faktoren, die zu diesem Mechanismus bei Mäusen beitragen können, zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass eine akute Kälteexposition nicht ausreicht, um den alternativen Syntheseweg auszulösen, da eine mindestens dreitägige Akklimatisierung erforderlich war, um die hepatische Cyp7b1-Expression zu induzieren. Diese Induktion war außerdem vom Ausmaß des Kältestresses abhängig, da die Unterbringung bei 6oC und 16oC die Expression von Cyp7b1 effizient förderte, während leichter Kältestress (22oC) die Cyp7b1-Konzentration nach einer kurzen Akklimatisierung nicht beeinflusste. Hinsichtlich der Regulierung von Cyp7b1 bei Kälteexposition wiesen Fasten-Fütterungs-Studien sowie die pharmakologische Hemmung von Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) und/oder 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMGCR) auf eine vernachlässigbare Rolle Insulin-abhängiger Signalwege bzw. der Cholesterinabsorption/-synthese hin. Andererseits induzierte die Supplementation eines spezifischen Agonisten für den nukleären Transkriptionsfaktor RORα die Expression von Cyp7b1 und steigerte die Gallensäuresynthese bei cholesterinreicher, fettreicher Ernährung. Die transkriptionelle Aktivierung durch RORa war jedoch nicht für die kälteinduzierte Expression des Enzyms notwendig. Darüber hinaus untersuchte diese Arbeit die Bedeutung von Cyp7b1-abgeleiteten Gallensäuren im systemischen Stoffwechsel durch Organaufnahmestudien mit radioaktiven Tracern in Wildtyp (WT) und Cyp7b1-/--Mäusen, die in thermoneutraler oder kalter Umgebung untergebracht waren. Die verminderte Aufnahme von 3H-Triolein und 14C-Cholesterin in der BAT von Kälte-akklimatisierten Cyp7b1-/--Mäusen unterstreicht die Bedeutung von Gallensäuren, die aus dem alternativen Syntheseweg stammen, für die Aktivierung und Etablierung thermogener Reaktionen. Im Zusammenhang mit chronischen Stoffwechselerkrankungen ist es bemerkenswert, dass die Umgebungstemperatur nicht nur eine wichtige Determinante der alternativen Gallensäuresynthese ist, sondern auch das Fortschreiten der stoffwechselassoziierten Fettlebererkrankung (MAFLD) maßgeblich beeinflusst. Zu diesem Zweck wurden zwei experimentelle Ansätze verfolgt, bei denen Cyp7b1-/- und Wildtyp-Mäuse entweder mit einer Methionin-Cholin-defizienten (MCD) oder einer Cholin-defizienten fettreichen Diät (CD-HFD) gefüttert und bei 30 °C (Thermoneutralität) oder bei 22 °C (leichter Kältestress) untergebracht wurden. Zur Untersuchung des Krankheitsphänotyps und der zugrundeliegenden Mechanismen wurden Plasma- und Organproben analysiert, um Stoffwechselparameter, die Infiltration von Immunzellen mittels Immunhistologie und Durchflusszytometrie sowie Lipidspezies einschließlich Hydroxycholesterine, Gallensäuren und strukturelle Lipide zu bestimmen. In der MCD-Studie führte die gewählte Dauer der milden Kälteexposition nicht zu einer Hochregulierung des alternativen Synthesewegs, so dass wir nicht auf eine signifikante Rolle von CYP7B1 in Bezug auf MAFLD-assoziierte Parameter schließen konnten. Im CD-HFD-induzierten Modell förderte die thermoneutrale Unterbringung jedoch die MAFLD sowohl bei WT- als auch bei Cyp7b1-defizienten Mäusen, wobei der Effekt bei den Knockout-Tieren deutlich stärker ausgeprägt war. Bei diesen Mäusen fanden wir eine höhere Alanin-Aminotransferase-Aktivität im Plasma, Hyperlipidämie, eine hepatische Anhäufung potenziell schädlicher Lipidspezies, eine verschlimmerte Leberfibrose, verstärkte Entzündungen und eine Infiltration von Immunzellen. Gallensäuren und Hydroxycholesterine korrelierten bei Cyp7b1-/--Mäusen, die thermoneutral gehalten wurden, nicht mit einer Verschlimmerung der MAFLD. Bemerkenswert ist, dass eine Hochregulierung von Lipoproteinrezeptoren bei 22 °C, nicht aber bei 30 °C in den Lebern von Cyp7b1-/--Mäusen festgestellt wurde, was darauf hindeutet, dass ein beschleunigter Stoffwechsel von Lipoproteinen, die lipotoxische Moleküle tragen, dem Fortschreiten der MAFLD entgegenwirkt. Zusammenfassend zeigen diese Studien die pathophysiologische Bedeutung des CYP7B1-abhängigen alternativen Gallensäuresynthesewegs für das Fortschreiten von MAFLD.