Titel: Characterizing Ligand-Binding Domains of TRPM2 and the P2X7 Ballast Domain
Sonstige Titel: Charakterisierung von TRPM2-Ligandenbindedomänen und der P2X7 Ballast-Domäne
Sprache: Englisch
Autor*in: Sander, Simon
GND-Schlagwörter: TRP-KanäleGND
StrukturbiologieGND
BiophysikGND
ElektrophysiologieGND
AdeninnucleotideGND
Erscheinungsdatum: 2022
Tag der mündlichen Prüfung: 2022-07-01
Zusammenfassung: 
The ion channels TRPM2 (transient receptor potential melastatin 2) and P2X7 (P2X purinoreceptor 7) are key players in immunity and inflammation and are both activated by adenine nucleotides: TRPM2 by ADPR (adenosine diphosphate ribose), and P2X7 by ATP (adenosine triphosphate), respectively.
TRPM2 is crucial for intracellular Ca2+ signaling and contains two nucleotide binding domains: N terminal MHR1/2 (TRPM homology region 1/2), that harbors a conserved ADPR binding site, and C terminal NUDT9 H (NUDT9 homology), which has different functionalities in different TRPM2 orthologues. The mechanisms behind the function of these domains are not fully elucidated.
In this dissertation, both domains were expressed and purified in isolated, soluble forms and biophysically characterized. Further experiments with MHR1/2 from zebrafish TRPM2 (drMHR1/2) showed that the ADPR derivatives 2´ deoxy ADPR (a superagonist of human TRPM2) and 8 Br ADPR (an antagonist of human TRPM2) bind to the isolated domain while cADPR (cyclic ADPR) and 8 Br cADPR do not, although both cyclic substances had been previously suggested to interact with TRPM2. Additionally, the results demonstrated that 2´ deoxy ADPR is no superagonist of zebrafish TRPM2. A crystal structure of isolated drMHR1/2 revealed a novel Zn2+-binding site that is conserved within the TRPM family and essential for structural integrity and function of TRPM2, as shown by electrophysiology. Moreover, calmodulin (CaM) was shown to bind to drMHR1/2, confirming a known IQ-like motif from human TRPM2.
P2X7 is an essential component of purinergic signaling and comprises a unique ballast domain (P2X7BD) that is crucial for the cytotoxic action of the receptor but not involved in channel gating. Its interplay with the ligands GDP (guanosine diphosphate) and CaM as well as the modulatory role for P2X7 function are not completely understood.
Here, two putative CaM-binding regions were identified in P2X7BD by a peptide-based binding approach and isolated human P2X7BD was shown to bind Ca2+-CaM. While this interaction destabilized the domain and disrupted its trimeric state, as shown by SAXS, GDP stabilized P2X7BD. This indicates that both ligands reversibly bind to P2X7BD in an equilibrium, providing a possible framework for the regulation of full-length P2X7.
Taken together, this dissertation revealed novel characteristics of important ligand-binding domains of TRPM2 and P2X7, respectively, which paves the way for future investigations regarding functional implications for the respective full-length channels.

Die Ionenkanäle TRPM2 (Transient Receptor Potential Melastatin 2) und P2X7 (P2X Purinoreceptor 7) spielen Schlüsselrollen in Immunitätsreaktionen und Entzündungs-prozessen. Beide werden durch Adenin-Nukleotide aktiviert: TRPM2 durch Adenosindiphosphat-Ribose (ADPR) und P2X7 durch Adenosintriphosphat (ATP).
TRPM2 ist maßgeblich am intrazellulären Ca2+-Signaling beteiligt und enthält zwei Nukleotid-Bindungsdomänen: Die N-terminale MHR1/2-Domäne (TRPM homology region 1/2) mit einer konservierten ADPR-Bindungsstelle und die C-terminale NUDT9 H-Domäne (NUDT9 homology), welche in verschiedenen TRPM2-Orthologen unterschiedliche Funktionen hat. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht gänzlich geklärt.
In dieser Dissertation wurden beide Domänen in isolierter, löslicher Form exprimiert, gereinigt und biophysikalisch charakterisiert. Weitere Experimente mit MHR1/2 aus Zebrafisch-TRPM2 (drMHR1/2) zeigten, dass die ADPR-Derivate 2' desoxy ADPR (ein Superagonist von menschlichem TRPM2) und 8 Br ADPR (ein Antagonist von menschlichem TRPM2) an die isolierte Domäne binden, cADPR (cyclic ADPR) und 8 Br cADPR jedoch nicht, obwohl Interaktionen beider zyklischen Substanzen mit TRPM2 zuvor diskutiert worden waren. Die Ergebnisse zeigten außerdem, dass 2' desoxy ADPR kein Superagonist von Zebrafisch-TRPM2 ist. Mithilfe einer Kristallstruktur von isoliertem drMHR1/2 wurde eine neue Zn2+-Bindestelle identifiziert, die innerhalb der TRPM-Familie konserviert und für die strukturelle Integrität und Funktion von TRPM2 essenziell ist, worauf elektrophysiologische Experimente hindeuteten. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Calmodulin (CaM) an drMHR1/2 bindet, was ein bekanntes IQ-like Bindemotiv von menschlichem TRPM2 bestätigt.
P2X7 ist essenzieller Bestandteil der purinergen Signaltransduktion und umfasst eine einzigartige C-terminale Ballast-Domäne (P2X7BD), die für die zytotoxische Wirkung des Rezeptors entscheidend ist, aber nicht an der Kanal-Aktivierung beteiligt ist. Das Zusammenspiel mit den Liganden GDP (Guanosindiphosphat) und CaM, sowie die modulierende Rolle für die P2X7-Funktion sind nicht vollständig verstanden.
In dieser Arbeit wurden durch einen peptidbasierten Bindungsansatz zwei mutmaßliche CaM-bindende Regionen innerhalb von P2X7BD identifiziert und es wurde gezeigt, dass isoliertes menschliches P2X7BD Ca2+-CaM bindet. Während diese Wechselwirkung die Domäne destabilisierte und ihren trimeren Zustand auflöste, wie durch SAXS gezeigt wurde, stabilisierte GDP P2X7BD. Dies deutet darauf hin, dass beide Liganden in einem Gleichgewicht reversibel an die isolierte Domäne binden, was eine mögliche Grundlage für die Regulierung des P2X7-Rezeptors bildet.
Insgesamt haben die Ergebnisse dieser Dissertation neue Eigenschaften wichtiger Liganden-Bindungsdomänen von TRPM2 und P2X7 offenbart, was Raum für weiterführende Forschung hinsichtlich funktioneller Implikationen für die jeweiligen Volllängen-Kanäle bietet.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9699
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-101696
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Tidow, Henning
Fliegert, Ralf
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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